V. Cấy truyền phôi cho dê cừu Tóm tắt
2. Tăng hiệu quả của kỹ thuật gây rụng trứng nhiều
Do thực tế rằng cừu dê là những gia súc sinh sản theo mùa nên chúng không phải lúc nào cũng biểu hiện động dục. Vì lý do đó nên sử lý trước bằng progestagen sau đó bằng gonadotrophin đối với con cho phôi. Không có sự khác biệt giữa những con cừu được gây rụng trứng nhiều bằng hai CIDR và những con cưù được sử lý bằng xốp có tẩm progestagen, nhưng sản lượng phôi thấp hơn sau khi gây động dục đồng pha bằng một CIDR hay xốp có tẩm progestagen ở liều thấp.
Các chế phẩm gonadotrophin được dùng cho gây rụng trứng nhiều
Gonadotrophin đầu tiên được dùng rộng rãi cho gây rụng trứng nhiều là PMSG (bây giờ được gọi là gonadotrophin nhau thai ngựa, eCG). Gonadotrophin nhau thai ngựa được tiêm (liều ở giữa 1000 và 2000 IU) 1 hay 2 ngày trước khi rút progestagen bằng một liều tiêm cơ do thời gian bán sinh trong cơ thể của chúng dài. Tác động kéo dài của hocmôn này có thể làm cho nguy cơ các nang trứng không rụng cao cùng với làm tăng mức estradiol của các nang trứng này. Estrogen này được coi là làm thay đổi sự di chuyển của giao tử trong đường sinh dục và vì vậy làm giảm tỷ lệ phôi thu được. ảnh hưởng phụ
như thế được giảm bằng trung hoà eCG bằng kháng thể monoclon sau khi bắt đầu kích thích nang trứng. Tiêm GnRH lúc động dục có thể là một cách thay thế cho việc tiêm kháng eCG. Thay đổi các sự kiện nội tiết và làm chín các tế bào trước lúc trưởng thành có thể giải thích cho hiệu quả kém của eCG.
Từ khi chế phẩm FSH có sãn, nhiều nghiên cứu so sánh hiệu quả với eCG đã được thực hiện ở những nghiên cứu này và những nghiên cứu được tiến hành ở các loài khác, FSH được coi là gonadotrophin ưu việt hơn so với eCG về sự rụng trứng và tỷ lệ
thụ thai và lượng phôi có chất lượng tốt. Mối quan hệ giữa phương pháp gây rụng trứng nhiều và liều hocmôn đối với các chế phẩm thương mại khác nhau FSH tuyến yên cừu và lợn đã sãn có. 6 dến 8 lần tiêm với khoảng cách 12 giờ bắt đầu 2 hay 3 ngày trước khi rút progestagen được yêu cầu do thời gian bán sinh của chúng ngắn (5 giờ đối với pFSH). Nhiều cố gắng đã được thực hiện để làm đơn giản hóa kỹ thuật này bằng một lần tiêm gonadotrophin để tiết kiệm thời gian và sức lực, pFSH được hoà tan hay không hoà tan trong PVP (polyvinylpyrrolidone), một dẫn suất tác động lâu. Không may rằng những số liệu này không được khẳng định bởi các tác giả khác. Tiêm một liều FSH kết hợp với liều eCG vừa phải (400-800IU) có thể vượt qua những bất lợi của mỗi gonadotrophin và được sử dụng rộng rãi một cách thương mại ở Australia.
Trong giữa những năm 1980, người ta đã chứng minh rằng các chế phẩm pFSH có thể
biểu hiện mức giao động lớn về tỷ lệ hoạt lực của FSH và LH và một lượng LH cao đã
ảnh hưởng ngược lên phản ứng của buồng trứng, tỷ lệ thụ thai và chất lượng phôi ở cừu và bò. Ngày nay, oFSH và pFSH tinh khiết đã có sãn. Tuy nhiên, một lượng LH tối thiểu là cần thiết sau khi rút progestagen (FSH/LH :0,3-0,4 ở hai lần tiêm cuối cùng, tương
ứng, đặc biệt là trong mùa không sinh sản ở cừu và dê, để tăng phản ứng rụng trứng nhiều và số phôi có khả năng cấy thu được.
Gây rụng trứng nhiều lặp lại và thu phôi
Các kỹ thuật thu phôi bằng phẫu thuật đối với cừu và dê được sử dụng ngày nay tương tự với các kỹ thuật đã được xuất bản trước đây. Lôi đường sinh dục ra ngoài thường dẫn đến viêm dính sau phẫu thuật, làm giảm sản lượng phôi ở lần phẫu thuật lặp lại sau
đó. Với sự phát triển của các phương pháp không phẫu thuật liên quan đến việc sử dụng nội soi, bây giờ có thể thu phôi nhiều lần từ một con cái mà không bị viêm dính sau phẫu thuật. Tuy nhiên, gây rụng trứng nhiều lặp lại bằng pFSH ở dê thường đi cùng với việc xuất hiện các kháng thể kháng FSH và giảm tỷ lệ rụng trứng sau lần điều trị thứ ba. Tuy nhiên, phản ứng gây rụng trứng nhiều được duy trì ở dê bằng điều trị nhiểu lần với một chế phẩm FSH của cừu.
Sự dao động trong phản ứng gây rụng trứng nhiều
Phổ biến ở bò là mức độ dao động cao về tỷ lệ rụng trứng và số phôi thu được sau khi gây rụng trứng nhiều đã được chứng minh, dao động này trong phản ứng là yếu tố hạn chế chính trong các chương trình cấy phôi ở tiểu gia súc nhai lại. Những con cho phôi không có phản ứng (<5 trứng rụng) (cừu :20%; dê :10%) không có giá trịđối với thu phôi dường như là các yếu tố mùa vụ, di truyền và dinh dưỡng làm cho dao động kết quả gây rụng trứng nhiều không kể đến các kỹ thuật gây rụng trứng nhiều được sử dụng. ảnh hưởng của dinh dưỡng không đủ lên sự thoái hoá của thể vàng trước lúc trưởng thành
đã được báo cáo nhưng các cơ chế gây ra điều đó vẫn cần phải nghiên cứu thêm. Tuy nhiên, sự đóng góp của dao động sinh lý như tình trạng của quần thể nang trứng ở thời
điểm bắt đầu điều trị gonadotrophin cũng không thể loại bỏ. Gần đây rBST (recombinant bovine somatotrophin) sãn có và cùng với hocmôn sinh trưởng (GH) trong việc điều hoà sinh trưởng của nang trứng ở bò đã được báo cáo. Điều trị bò hậu bị với GH trước các hocmôn gonadotrophin dẫn đến phản ứng gây rụng trứng nhiều tốt hơn và tăng số
lượng phôi có thể cấy. ở cừu, mặc dầu số lượng cho thấy tăng số lượng nang trứng 2- 3mm sau khi điều trị GH, tỷ lệ gây rụng trứng nhiều do gonadotrophin không bị thay đổi so với không điều trị GH. ở dê, điều trị bốn tuần bằng rBST không có ảnh hưởng đến chức năng buồng trứng và không ảnh hưởng đến eCG gây tỷ lệ rụng trứng. Mức độ của phản ứng buồng trứng với pFSH ở cừu có liên quan dương với số lượng các nang trứng nhỏ 1-2mm và có liên quan âm đến số lượng các nang trứng lớn hơn, khi quan sát bằng nội soi ngay trước khi tiêm gonadotrophin. Vì thế, điều trị trước hai tuần bằng GnRH agonist (Buserelin) có thể tăng số trứng rụng và giảm sự dao động phản ứng với pFSH giữa những gia súc bằng việc ức chế các nang trứng lớn (Bảng 1).
Bảng 15. ảnh hưởng của hai tuần tiêm 50μg/ngày Buserelin lên số trứng nhỏ(1-2mm) và nang trứng lớn (3-5mm) có mặt trước khi điều trị pFSH và lên phản ứng gây rụng trứng
nhiều đối với pFSH.
Điều trị Số lượng cừu Số lượng các nang trứng nhỏ?SD/cừu Số lượng các nang trứng lớn ?SD/cừu Trung bình tỷ lệ rụng trứng ?SD pFSH một mình aGnRH + pFSH 9 9 9.5?3.6 21.8?5.2 P<0.01 7.3?1.3 0 13.2?5.5 19.2?4.1 P<0.05
Tiêm GnRH antagonist (0,5mg/ngày trong 10 ngày) cũng có thể được sử dụng để thay thế Buserelin với cùng hiệu quả và được sử dụng thường xuyên ở chương trình cấy phôi Lacaune ở Pháp (bảng 2)
Bảng 16. Tỷ lệ rụng trứng, sản lượng phôi và khả năng sống của phôi sau khi cấy phôi tươi cho con nhận ở cừu Lacaune.
Tỷ lệ rụng trứng ?Sệ DễNG Số trứng thu được Tỷ lệ trứng thụ tinh Tỷ lệ phôi thoái hoá Tỷ lệ phôi có khả năng cấy Số phôi có khả năng cấy/con cho Tỷ lệ cừu được sinh ra/số phôi cấy 22.3?7.5 356 87.4 11.5 75.8 10.4 67.4 Số cừu cho phôi :26
Các kết quả này khẳng định những kết quả đã đạt được nhiều năm trước đây của Brebion và cs (1992), những người đã đạt được sản lượng phôi cao hơn và số cừu sinh ra trên mỗi con cho cao hơn khi sử dụng GnRH antagonist trước khi điều trị (12,5 và 8,2) so với các kết quả của các kỹ thuật cấy truyền phôi hiện nay (6,8 và 4,5 tương ứng).
Không thụ tinh sau gây rụng trứng nhiều
Thụ tinh thành công của cái cho phôi cũng phụ thuộc vào sự đồng pha giữa thời gian phối giống và rụng trứng. Giảm sự dao động của thời gian rụng trứng và tăng tỷ lệ trứng rụng có thể đạt được bằng tiêm GnRH ở một thời gian cố định sau khi rút progestagen. Tuy nhiên, sau khi gây rụng trứng bằng GnRH một đợt bùng nổ rụng trứng mới đã quan sát được 12-14 giờ sau đợt bùng nổ thứ nhất ở 60% những cừu được điều trị. Một phương pháp thay thế khác là sử dụng GnRH antagonist sau 12 giờ rút mút tẩm progesterone, tiếp theo bằng lần tiêm pLH 24 giờ sau. Điều này giống như một đợt dâng lên trước rụng trứng và cho phép phối giống theo chương trình ở dê được gây rụng trứng nhiều.
Một yếu tố chính ảnh hưởng đến số lượng phôi tốt đạt được sau khi phối giống cho cừu
được gây rụng trứng nhiều là tỷ lệ trứng thụ tinh ở con cho có nhiều hơn 10-12 trứng rụng. Sau khi phối giống qua tử cung hay âm đạo, tỷ lệ thụ tinh ở con cho phản ứng cao là thấp, thậm chí sau 2 hay 3 lần phối giống, do sự di chuyển của tinh trùng bị giảm qua cổ tử cung. Vì vậy, tỷ lệ thụ tinh cao có thể đạt được bằng phẫu thuật bằng cách đưa
trực tiếp đưa tinh trùng vào sừng tử cung. Gần đây, thụ tinh trong tử cung bằng vi phẫu thuật sau 48 giờ rút xốp có tẩm progesterone và cho kết quả thụ tinh cao và tần xuất thấp phôi bị thoái hoákhông kể đến tỷ lệ rụng trứng, cho thấy khả năng bẩm sinh của tế
bào trứng đểđược thụ thai không bị tổn thương bằng gây rụng trứng nhiều với FSH.