Phần III VẬT LIỆU, NỘI DUNG PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.1. Phương pháp bố trắ các thắ nghiệm
3.3.1.1. Phân lập nấm mốc gây bệnh trên chuối
Tiến hành theo phương pháp của Jinyoung Lim (2002): Chuối bị bệnh ựược cắt thành các miếng nhỏ kắch thước 1cm và ựược khử trùng bề mặt trong dung dịch cồn 70% trong 1 phút. Rửa lại bằng nước cất vô trùng và làm khô dưới dòng khắ. Mẫu ựược ựặt trên môi trường PDA bổ sung 100 ộg/ml streptomycin và 25 ộg/ml acid lactic, nuôi cấy tại 28oC. Sau 10 ngày nấm ựược cấy truyền sang môi trường PDA mới. Bào tử ựơn ựược tách bằng phương pháp pha loãng trên môi trường thạch (WA) và nuôi cấy trên PDA 5 ngày tại 25oC. Chủng nấm bệnh ựược cấy truyền sang PDA thạch nghiêng và giữ ở 4oC. Kiểm tra lại ựộ thuần chủng của khuẩn lạc lựa chọn. Quan sát sự sinh trưởng của nấm qua vết cấy trên môi trường thạch nghiêng. Nếu vết cấy có bề mặt và màu sắc ựồng ựều, thuần nhất chứng tỏ giống mới phân lập tinh khiết thì giữ lại. Giữ giống trong tủ lạnh ở 4oC.
* định loại nấm gây bệnh
Cấy chấm ựiểm ựể nghiên cứu ựặc ựiểm vĩ mô theo phương pháp của Pitt and Hocking, 1997: Chuẩn bị dung dịch A (0,2% agar + 0,05% tween
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 38
80), dung dịch B (bào tử nấm trong nước vô trùng). Trộn ựều dung dịch A và dung dịch B tỷ lệ 1:1 ta thu ựược dung dịch C. Lấy 2 ộl dung dịch C ựặt vào 3 ựiểm (hoặc 1 ựiểm) trên mặt thạch của hộp petri chứa môi trường PDA. Nuôi cấy 7 ngày ở 28oC.
Làm tiêu bản ựể quan sát hình thái nấm mốc dưới kắnh hiển vi có gắn máy chụp ảnh: nhỏ một giọt nước:cồn (2:1) lên lam kắnh, dùng que cấy mốc lấy mốc trong ống thạch nghiêng ựặt trên tiêu bản. Rửa tiêu bản bằng dung dịch nước:cồn trên, nhỏ một giọt xanh methylene, ựậy lá kắnh, ựể khô, tiến hành soi kắnh.
Các chỉ tiêu quan sát: màu sắc bào tử, ựường kắnh khuẩn lạc, màu sắc hệ sợi, màu sắc mặt sau khuẩn lạc, kắch thước và hình dạng bào tử trần, cuống ựắnh bào tử.
định tên C. musae theo Prema et al., 2011.
định tên L. theobromae theo Shah et al., 2010, Kumar et al, 2009 và Grif et al., 1909.
định tên C. paradoxa theo Dede and Okungbowa, 2007; Yadahalli, 2005.
định tên Fusarium theo khóa phân loại của Nelson. định tên Aspergillus theo khóa phân loại của Klich. định tên Rhizopus theo khóa phân loại của Nelson.
3.3.1.2. Phương pháp ựánh giá khả năng ựối kháng của chủng Trichoderma spp. với một số loài nấm gây bệnh chắnh trên chuối trong ựiều kiện invitro và in vivo.
a. Trong ựiều kiện in vitro: Tiến hành theo phương pháp nuôi Dual của Dennis và Webster (1979).
Mẫu ựối chứng, trên ựĩa peptri có ựường kắnh 9cm ựổ 20ml môi trường PDA, ựể khô. Căn 2 vị trắ ựối diện nhau trên ựĩa peptri sao cho mỗi vị trắ cách mép ựĩa peptri 1,5cm, rồi tiến hành ựục 1 lỗ thạch ựường kắnh 8mm trong 2 vị
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 39
trắ trên. Một mảnh sợi nấm ựường kắnh 6mm của từng loại nấm gây bệnh (Collectotrichum musae CM2, Lasiodiplodia theobromae LT3, Thielaviopsis paradoxa TP3) ựã nuôi cấy 7 ngày trên môi trường PDA ựược ựặt vào lỗ thạch ựã ựục (hình 3.1a). Nuôi cấy ở nhiệt ựộ 28 Ờ 30oC.
Mẫu thắ nghiệm, trên ựĩa peptri có ựường kắnh 9cm ta ựổ 20ml môi trường PDA, ựể khô. Dùng ựục lỗ thạch hình trụ ựã vô trùng (có ựường kắnh 8mm) ựục 2 lỗ ựối diện nhau trên ựĩa peptri sao cho mỗi lỗ cách mép ựĩa peptri 1,5cm. Một mảnh sợi nấm ựường kắnh 6mm của từng loại nấm gây bệnh (Collectotrichum musae CM2, Lasiodiplodia theobromae LT3,
Thielaviopsis paradoxa TP3) ựã nuôi cấy 7 ngày trên môi trường PDA ựược ựặt vào một lỗ thạch. Tương tự một mảnh sợi nấm của từng chủng
Trichoderma spp. ựược ựặt vào vị trắ lỗ thạch còn lại (hình 3.1b). Nuôi cấy ở nhiệt ựộ 28 Ờ 30oC. Bán kắnh khuẩn lạc của nấm gây bệnh theo hướng ựối diện với nấm Trichoderma spp. ựược ựo sau 7 ngày nuôi cấy, mỗi thắ nghiệm ựược lặp lại 3 lần.
Tỷ lệ ức chế sự sinh trưởng phát triển của nấm Trichoderma spp. với các nấm gây bệnh trên chuối ựược tắnh theo công thức
PIRG = (R1 Ờ R2)/ R1 ừ 100 Trong ựó:
PIRG: Tỷ lệ ức chế sự phát triển hệ sợi nấm (Percent Inhibition of Mycelia Growth)
R1: Bán kắnh của khuẩn lạc nấm bệnh trong ựĩa ựối chứng R2: Bán kắnh của khuẩn lạc nấm bệnh trong ựĩa thắ nghiệm
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 40
Hình 3.1. Phương pháp cấy ựổi kháng trực tiếp
b. Trong ựiều kiện in vivo:
- Chuẩn bị chuối thắ nghiệm: theo phương pháp của G. Sangeetha et al. (2009).
Chuối trưởng thành 75-80% không có vết thâm và không bị thối hỏng, ựược rửa dưới vòi nước chảy ựể loại bỏ bụi bẩn, sau ựó ựược khử trùng bề mặt bằng cồn 70%, ựể khô 6 giờ ở nhiệt ựộ phòng.
- Xác ựịnh khả năng ựối kháng của chủng Trichoderma spp. với các nấm gây bệnh trên chuối: theo phương pháp của Mortuza and Ilag (1999).
Quả chuối ựược tạo 2 vết thương có ựường kắnh 10mm, sâu ựến 2/3 ựộ dày vỏ quả bằng kim vô trùng, 200ộl hỗn dịch bào tử của chủng Trichoderma
spp. (có mật ựộ bào tử 108 BT/ml) ựược ựưa vào 1 vết thương, ựể khô, sau ựó tiếp tục nhỏ 200ộl dịch bào tử của nấm gây bệnh vào vết thương này. Ở vết thương còn lại, 200ộl dịch bào tử của nấm gây bệnh ựược ựưa vào như mẫu ựối chứng. Nồng ựộ của nấm gây bệnh là 104BT/ml. Chuối ựược ựặt trong khay nhựa và ủ ở nhiệt ựộ 28ổ2oC. Thắ nghiệm ựược lặp lại 3 lần. đường kắnh thối hỏng tại vết thương ựược ựo sau 7 ngày, tỷ lệ giảm thối hỏng trên chuối ựược tắnh theo công thức: RCO = (R1- R2)/ R1 x 100
Trong ựó:
RCO: tỷ lệ giảm thối hỏng quả (%)
R1: ựường kắnh thối hỏng của mẫu ựối chứng (chỉ có nấm gây bệnh) R2: ựường kắnh thối hỏng của mẫu thắ nghiệm (có nấm gây bệnh và nấm Trichoderma spp.)
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 41
3.3.1.3. Phương pháp nghiên cứu ứng dụng chế phẩm Trichoderma spp. trong bảo quản chuối tiêu
a. Ảnh hưởng của nồng ựộ nấm T. asperellum TR17 ựến khả năng ựối kháng với các nấm gây bệnh chắnh trên quả chuối
Tiến hành theo phương pháp của Mortuza và Ilag (1999) ựã ựược miêu tả ở mục 3.3.1.2. Nồng ựộ nấm T. asperellum TR17khảo sát là 106, 107, 108 bào tử/ml.
b. Ảnh hưởng của chitosan, T. asperellum TR17 trong kiểm soát thối hỏng chuối gây ra bởi các nấm bệnh chắnh trên quả chuối.
Tiến hành theo phương pháp của Ting Yu et al. (2012)
Chuối ựược chuẩn bị và tạo các lỗ như mục 3.3.1.2. để ựánh giá ảnh hưởng của chitosan, T. asperellum TR17 trong kiểm soát thối hỏng chuối, 50ộl của mỗi công thức sau ựây ựược nhỏ vào các vết thương.