M Ở ĐẦU
2.3.2. Phương pháp nghiên cứu công nghệ trích ly các chất flavonoid từvỏ
hành, vỏ quả citrus và phế thải chè
2.3.2.1. Phương pháp nghiên cứu xử lý nguyên liệu
- Nguyên liệu vỏ hành và chè tươi có độ ẩm khoảng 20-70%. Để thuận lợi cho quá trình chiết tách các chất flavonoid, chúng tôi tiến hành khảo sát nhiệt độ sấy và độ mịn của nguyên liệu
- Nguyên liệu vỏ quả họ citrus: dễ bị thối, mốc đen, cứng do đó cần xử lý theo 1 trong 3 phương pháp sau [39, 41, 42, 50]:
2.3.2.2. Phương pháp nghiên cứu lựa chọn dung môi trích ly
Dung môi đóng vai trò quan trọng trong quá trình trích ly
- Đối với quá trình trích ly các chất flavonoid từ vỏ hành (chứa quercetin và dẫn xuất) và phế thải chè (catechin và dẫn xuất) dung môi thường được sử dụng là EtOAc, MeOH, EtOH với nồng độ 50-80%. Chúng tôi tiến hành khảo sát với các loại dung môi: EtOAc, MeOH, EtOH, MeOH 70%, EtOH 70% [39, 41, 42, 50, 85]. Vỏ citrus Làm khô Nghiền Bột vỏ (Phơi nắng) Vỏ citrus Lạnh đông Ép Cắt nhỏ Sấy khô Bột vỏ quả citrus Nghiền Vỏ citrus Rửa Ngâm, rửa Nước Na2S2O3 0,5% Ly tâm nhẹ Cắt nhỏ Sấy khô Bột vỏ quả citrus Nghiền 5 – 10 phút 50 – 55 oC 12 – 24 ờ (Qua rây 1,5mm)
- Đối với quá trình trích ly các chất flavonoid từ vỏ quả citrus (naringin và hesperidin là chất glycoside) dung môi thường được sử dụng là nước nóng trong pH kiềm (9-12) và EtOH [26].
2.3.2.3. Phương pháp nghiên cứu lựa chọn phương pháp trích ly
Các phương pháp trích ly được khảo sát là: trích ly tĩnh, trích ly động và trích ly hồi lưụ Hiệu suất thu nhận sản phẩm, chất lượng sản phẩm và giá trị kinh tế là căn cứ chủ yếu để lựa chọn phương pháp trích ly thích hợp nhất.
2.3.2.4. Phương pháp nghiên cứu lựa chọn các điều kiện công nghệ trích ly thích hợp thích hợp
Để nghiên cứu lựa chọn các điều kiện công nghệ thích hợp cho quá trình khai thác các chất flavonoid từ vỏ hành, vỏ quả họ citrus, phế thải chè, chúng tôi dựa trên nguyên tắc: Khi nghiên cứu khảo sát một yếu tố nhất định thì các thí nghiệm đều được tiến hành ở cùng các điều kiện công nghệ (trừ yếu tố đang được khảo sát). Sau khi đã chọn được giá trị thích hợp của từng yếu tố thì các giá trị đó được cố định trong các thí nghiệm tiếp theo để khảo sát các yếu tố còn lạị
Các yếu tố công nghệ được khảo sát là: - Dung môi
- Số lần trích ly
- Tỷ lệ nguyên liệu / dung môi - Nhiệt độ trích ly
- Thời gian trích ly - Tốc độ khuấy trộn
Việc lựa chọn các giá trị thích hợp của yếu tố công nghệ dựa vào hiệu suất trích ly, hàm lượng các hợp chất flavonoid thu được, hiệu quả kinh tế [39, 41, 42, 50].
2.3.3. Phương pháp nghiên cứu công nghệ tinh chế làm sạch các chất flavonoid từ vỏ hành, vỏ quả học citrus và phế thải chè từ vỏ hành, vỏ quả học citrus và phế thải chè
Cao chiết flavonoid từ vỏ hành, vỏ quả họ citrus, phế thải chè được tinh chế bằng phương pháp trích ly với hệ dung môi chọn lọc nhằm loại bỏ các hợp chất hữu cơ không mong muốn, nâng cao độ tinh khiết. Phương pháp tinh chế như sau:
Cho cao chiết thu được sau khi trích ly và đuổi dung môi, được pha với nước tỷ lệ 1/10, cho vào phễu chiết. Sau đó dùng dung môi không phân cực CH2Cl2 rửa nhằm loại bỏ chlorophyl, các chất màu, cafein, và các chất phân cực kém trong phễu chiết. Lớp dưới (dung dịch trong CH2Cl2) được tách ra loại bỏ. Lớp trên (phần dung dịch trong nước) được trích ly với dung môi hữu cơ để thu nhận cao chiết tinh sạch. Các lớp tan trong dung môi hữu cơ được hợp lại và làm khô bằng Na2SO4 khan. Tiếp đó, lọc bỏ phần chất rắn, dung dịch trong suốt thu được đem đuổi kiệt dung môi trên thiết bị cô quay chân không sẽ thu được các chất flavonoid. Các chất flavonoid tiếp tục làm sạch bằng phương pháp kết tinh để thu nhận flavonoid tinh sạch [26, 39, 85].
Có nhiều yếu tố ảnh hưởng tới quá trình tinh chế các hợp chất flavonoid, ở đây chúng tôi chỉ khảo sát 3 yếu tố chính: dung môi trích ly, số lần trích ly, tỷ lệ cao chiết thô/dung môị Hiệu suất thu nhận cao chiết tinh sạch, hàm lượng polyphenols tổng và hiệu quả kinh tế là căn cứ chủ yếu để lựa chọn yếu tố công nghệ thích hợp nhất. Chúng tôi tiến hành khảo sát như sau:
- Dung môi trích ly: CH2Cl2, EtOAc, ete petrol, n-hexan - Số lần trích ly lại (lần): 1, 2 và 3
- Tỷ lệ cao chiết thô/dung môi (g/ml): 1/12, 1/14; 1/16; 1/18 và 1/20.
2.3.3.2. Nghiên cứu phương pháp làm sạch (phân lập các chất flavonoid)
+ Phương pháp sắc ký cột: dùng để tách loại đường, axit ra khỏi cao chiết flavonoid. Sắc ký cột được nhồi gel là nhựa hấp phụ Amberlite XAD-2 cho nguyên liệu hấp phụ vào trong gel, sau đó dùng dung môi rửa giải là nước để tách các chất tan trong nước là đường, axit và dung môi rửa giải EtOH để thu nhận các chất tan trong dung môi hữu cơ [77-79].
+ Hợp chất flavonoid tiếp tục được tinh chế đơn giản nhất bằng phương pháp kết tinh hoặc tách trên hệ phân tách cột đồng bộ Flash 150 Binary system điều kiện tách: cột ODS-C18 kích thước 250xØ20 mm, dung môi MeOH/H2O (v/v) vận tốc dòng chảy 10 ml/phút, UV= 280 nm. Các chất được phân lập qua hệ thống thiết bị này thường có độ tinh khiết ≥ 95%.
+ Phương pháp làm sạch các chất flavonoid bằng phương pháp kết tinh: Đun nóng dịch chứa flavonoid đến nhiệt độ 800C, kết tinh flavonoid bằng cách nhỏ dung môi khác (không làm tan chất kết tinh) đã được làm lạnh để tạo mầm kết tinh hoặc có thể kết tinh bằng cách thay đổi môi trường pH kiềm hoặc axit. Sau đó làm lạnh đến 10oC trong 24 giờ, lọc rửa kết tinh thu được flavonoid tinh sạch.
2.3.4. Phương pháp phân tích sản phẩm
2.3.4.1. Phương pháp xác định thành phần các chất flavonoid
Thành phần và hàm lượng các chất flavonoid có trong nguyên liệu được xác định bằng phương pháp phân tích sắc ký lỏng cao áp HPLC [24, 41, 45,46].
Phương pháp sắc ký lỏng cao áp HPLC: được thực hiện trên thiết bị Shimadzu LC-10Avvp, detector Shimadzu SPD - 10Avp UV-Vis. Với các điều kiện: hệ dung môi với pha động 70% acetonitrile, 0.2% formic acid (A) và 20% acetonitrile, 0.2% formic acid (B), cột tách (100 mm x 2.0 mm); xác định ở bước sóng 280 nm, vận tốc dòng chảy 1 ml/phút. Định lượng các thành phần theo tỷ lệ phần trăm diện tích peak của nó trên tổng diện tích các peak có trong hỗn hợp.
Việc phân tích sản phẩm được tiến hành tại Phòng Thử nghiệm sắc ký – VILAS 335 thuộc Trung tâm Giáo dục và Phát triển sắc ký – Trường Đại học Bách khoa Hà Nội hoặc phân tích trên thiết bị phân tách cột đồng bộ Flash 150 Binary system tại Trung tâm Dầu, Hương liệu & PGTP, Viện Công nghiệp thực phẩm.
2.3.4.2. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học
+ Phân tích khối phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR; H1-NMR, C13-NMR, COSY, HMBC ... tiến hành tại Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.3.4.3. Phương pháp phân tích, đánh giá chất lượng cao chiết flavonoid
+ Phương pháp xác định flavonoid tổng mục 2.3.1. + Phương pháp phân tích HPLC [2, 41, 53, 77].
+ Xác định tổng lượng kim loại nặng theo TCVN 3801-83.
+ Phương pháp vi sinh: Chất lượng sản phẩm về chỉ tiêu vi sinh vật được thực hiện tại trung tâm ASE, Thành phố Hồ Chí Minh.
- Tổng số vi sinh vật hiếu khí - Ẹ Coli
- Samonella
Xác định thành phần và cấu trúc hóa học của các hợp chất flavonoid
Nghiên cứu phương pháp bảo quản sản phẩm
Phân tích và đánh giá chất lượng sản phẩm Xây dựng qui trình công nghệ sản xuất qui
mô thực nghiệm Nguyên liệu (Vỏ hành, Vỏ quả họ citrus, Phế thải chè) Sơđồ 2.1: Sơđồ nghiên cứu Ứng dụng sản phẩm Flavonoid vào sản xuất chế phẩm TPCN Nghiên cứu công nghệ trích ly các hợp chất flavonoid •Phân tích, xử lý nguyên liệu - Nhiệt độ sấy ; Độ mịn •Lựa chọn dung môi trích ly •Lựa chọn phương pháp trích ly •Lựa chọn các điều kiện công nghệ trích ly - Tỷ lệ NL/DM ; Số lần trích ly - Thời gian trích ly ; Tốc độ khuấy trộn Nghiên cứu công nghệ làm sạch các hợp chất flavonoid •Lựa chọn phương pháp làm sạch •Lựa chọn dung môi làm sạch
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả nghiên cứu về các hợp chất flavonoid có trong vỏ hành 3.1.1. Nghiên cứu xác định thành phần và cấu trúc của các hợp chất 3.1.1. Nghiên cứu xác định thành phần và cấu trúc của các hợp chất flavonoid có trong vỏ hành
3.1.1.1. Nghiên cứu đánh giá chất lượng nguyên liệu vỏ hành
ạ Khảo sát nguyên liệu vỏ củ hành: Hành củ được trồng khắp mọi nơi ở nước ta, các vùng trồng nhiều hành là Phan Rang, Đà Lạt, Vĩnh Phú, Hà Bắc, Hà Nội, Hải Dương, Nghệ An… Củ hành được dùng làm gia vị, hoặc chế biến thành hành muối, hành khô thái lát hoặc hành phi để tiêu thụ trong nước hoặc xuất khẩụ Hàng năm tại các vùng đặc sản của cây hành như Nam Sách-Hải Dương, Ninh Hiệp-Hà Nội đã cung cấp hàng ngàn tấn hành đã chế biến cho thị trường trong nước như TPHCM, Bình Dương, Đà Nẵng, Hà Nội, Hải Phòng và xuất khẩu sang Nhật Bản, Ấn Độ, Hàn Quốc, Úc... lượng vỏ thải ra rất nhiều, trung bình mỗi tháng tại mỗi cơ sở sản xuất tổng lượng vỏ hành thải ra lên đến khoảng 10 tấn, hiện chưa được sử dụng - đây là nguồn nguyên liệu rất dồi dào có thể tận dụng để khai thác flavonoid.
b. Phân tích đánh giá chất lượng nguyên liệu vỏ hành:
Để đánh giá được chất lượng nguyên liệu vỏ hành, chúng tôi tiến hành xác định hàm lượng các thành phần chính có trong nguyên liệu, bao gồm: độ ẩm, hàm lượng flavonoid tổng, protein, tinh bột và xenlulozạ
Các mẫu vỏ hành được lấy là vỏ hành tây và vỏ hành ta tại Nam Sách - Hải Dương và Ninh Hiệp - Hà Nộị Kết quả được thể hiện ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Xác định các thành phần chính của vỏ hành
Hàm lượng tính theo tổng lượng chất khô, % Mẫu nguyên liệu Độẩm
% Flavonoid
tổng Xenluloza Tinh bột Protein
Vỏ hành tây 27,2 2,50 17,2 8,1 32,3 Nam Sách Vỏ hành ta 27,6 2,53 17,7 8,5 32,7 Vỏ hành tây 27,4 2,51 16,5 8,4 31,9 Ninh Hiệp Vỏ hành ta 27,5 2,52 17,5 8,3 32,8
Theo kết quả thu được cho thấy các thành phần chính của các mẫu vỏ hành tây và hành ta các vùng Nam Sách và Ninh Hiệp tương đối giống nhaụ Hàm lượng flavonoid có trong các mẫu hành tây và hành ta không khác nhau, nên trong quá trình sản xuất ta có thể dùng cả vỏ hành tây và hành tạ Ngoài ra, hàm lượng tinh bột và protein thấp nên không cản trở cho quá trình trích ly, tuy nhiên hàm lượng xeluloza cao vì vậy cần phải xay nhỏ để flavonoid dễ dàng thoát ra khỏi nguyên liệụ
3.1.1.2. Xác định cấu trúc hoá học của các chất flavonoid có trong vỏ hành
ạ Tách các chất flavonoid từ vỏ củ hành
Vỏ hành khô (100 g) được trích ly 3 lần với 1 lít MeOH trong thời gian 2 giờ, sau đó đuổi dung môi, thu được cao chiết MeOH (10,3 g). Cặn chiết MeOH được cho chạy qua cột sắc ký lỏng Amberlite XAD-2 (30xØ6,0 cm) với dung môi rửa giải H2O (2 lít) để loại các chất tan trong nuớc, sau đó rửa giải bằng MeOH (2 lít), cô đặc thu được flavonoid thô (5,10 g).
Flavonoid thô (5,10 g) được cho chạy qua sắc ký cột silica gel column (15x Ø3,4 cm BW-820MH, 70–200 mesh), với dung môi rửa giải MeOH/CHCl3 và MeOH, các phân đoạn được kiểm tra bằng sắc ký bản mỏng TLC với chloroform/methanol/acetic acid (80:20:1, v/v), với chỉ thị mầu 50% H2SO4 hoặc hỗn hợp 0,2% FeCl3 và 0,5% o-phenanthroline trong cồn để xác định các chất flavonoid. Gộp các phần có cùng Rf thu được phân đoạn I (1,11 g) với dung môi rửa giải CHCl3/MeOH (90:10, v/v), phân đoạn II (0,87 g) and III (0,25 g) với dung môi rửa giải CHCl3/MeOH (85:15, v/v), và phân đoạn IV (1,17 g) với dung môi rửa giải CHCl3/MeOH (80:20, v/v), phân đoạn I–IV tiếp tục tinh chế bằng sắc ký lỏng cao áp HPLC cột Inertsil PREP-ODS 250xØ20 mm, vận tốc dòng chảy 10 ml/min, UV = 280 nm, ta tách được các chất tinh khiết 1 (102,7 mg); 6 (314,6 mg) từ phân đoạn I; chất 5 (38,5 mg) và 9 (86,8 mg) từ phân đoạn II; chất 2 (18,5 mg) từ phân đoạn III; và chất 3 (83,9 mg); 4 (16,3 mg); 7 (45,7 mg); 8 (52,6 mg) được tách từ phân đoạn IV.
Các chất tinh khiết tách từ vỏ củ hành đựơc phân tích bằng các phương pháp phân tích hiện đại LC-MS, Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H NMR, 13C NMR, HMBC, HMQC, COSY để xác định cấu trúc hoá học.
b. Xác định cấu trúc hoá học
Kết quả phân tích của các chất 1–9.
¾Protocatechuic acid (3,4-dihydroxy benzoic acid, 1): chất rắn màu vàng nhạt; [α] 24D +18,8 (c 0,56, methanol); UV (methanol) λ max (log ε) 257 (4,03) and 294 (3,80) nm; APCIMS (negative) m/z 153,00 ([M − H]−, 100%); 1H NMR (CD3OD) δ 6,82 (d, J = 8,1 Hz, 1H, H-5); 7,45 (d, J = 8,4 Hz, 1H, H-6); và 7,46 (s, 1H, H-2); 13C NMR (CD3OD) δ 115,8 (C-2); 117,7 (C-5); 123,2 (C- 1); 123,9 (C-6); 146,1 (C-3); 151,5 (C-4); và 170,4 (COOH).
¾2-(3,4-dihydroxybenzoyl)-2,4,6-trihydroxy-3(2H)-benzofuranone (2): chất rắn mầu nâu đỏ; [α] 24D +5.5 (c 0.49, methanol); UV (methanol) λ max (log ε) 291 (4,39); ESIMS (positive) m/z 340,95 ([M + Na]+, 100%); 319,00 ([M + H]+, 10); 301,05 ([M − OH]+, 15); ESIMS (negative); m/z 316,90 ([M − H]−, 100%); 1H NMR (CD3OD) δ 5,97 (s, 1H, H-6); 6,00 (s, 1H, H-8); 6,79 (d, J = 8,0 Hz, 1H, H-5'); 7,59 (đ, J = 2,3; 8,0 Hz, 1H, H-6'); và 7,62 (d, J = 2,3 Hz, 1H, H-2'). 13C NMR (CD3OD) δ 92,1 (C-8); 97,9 (C-6); 102,0 (C-4a); 105,6 (C- 3); 115,6 (C-5'); 118,2 (C-2'); 125,4 (C-6'); 126,6 (C-1'); 146,1 (C-3'); 152,9 (C- 4'); 160,4 (C-8a); 171,2 (C-5); 174,0 (C-7); 191,7 (C-4); và 193,4 (C-2). ¾2-[4-(β-D-glucopyranosyl)-3-hydroxyphenyl]-3,5,7-trihydroxy-4H-1- benzopyran-4-one (quercetin 4'-O-β-D-glucopyranoside, 3): chất rắn màu vàng; [α] 24D –65,5 (c 0,40, methanol); UV (methanol) λ max (log ε) 253 (4,37) and 364 nm (4,34); ESIMS (positive) m/z 487,10 ([M + Na]+, 60%), 465,20 ([M + H]+, 100); ESIMS (negative) m/z 463,05 ([M − H]−, 100%), 300,90 ([C15H9O7]−, 5); 1H NMR(CD3OD) δ 3,47 (m, 1H, H-4"); 3,50 (m, 1H, H-5"); 3,55 (m, 1H, H-3"); 3,56 (m, 1H, H-2"); 3,76 (đ, J = 5,2; 12,0 Hz, 1H, H-6"a); 3,95 (đ, J = 2,3; 12,0 Hz, 1H, H-6"b); 4,92 (d, J = 6,9 Hz, 1H, H-1"); 6,15 (s, 1H, H-6); 6,63 (s, 1H, H-8); 7,25 (d, J = 8,6 Hz, 1H, H-5'); 7,65 (d, J = 8,6 Hz,
1H, H-6'), và 7,71 (s, 1H, H-2'). 13C NMR (CD3OD) δ 62,5 (C-6"); 71,4 (C-4"); 74,9 (C-2"); 77,6 (C-5"); 78,4 (C-3"); 94,5 (C-8); 99,4 (C-6); 103,5 (C-1"); 104,6 (C-4a); 116,5 (C-2'); 117,6 (C-5'); 121,3 (C-6'); 127,6 (C-1'); 137,9 (C-3); 146,8 (C-3'); 147,8 (C-2); 148,1 (C-4'); 158,2 (C-8a); 162,5 (C-5); 165,7 (C-7); và 177.4 (C-4).
¾4: chất rắn màu nâu-đỏ; [α] 24D +122,0 (c 0,25, methanol); UV (methanol) λ max (log ε) 291 (4,28); ESIMS (positive) m/z 634,10 ([M + H2O]+, 100%); 455,15 ([C22H15O11]+, 45); 301,60 ([C15H9O7]+, 15); ESIMS (negative)
m/z 615,10 ([M − H]−, 100%); 1H NMR (CD3OD) δ 3,39 (m, 4H, H-4"); 3,42 (m, H, H-5"); 3,47 (m, H, H-3"); 3,49 (m, H, H-2"); 3,69 (đ, J = 5,2; 12,0 Hz, 1H, H-6"a); 3,89 (d, J = 12,0 Hz, 1H, H-6"b); 4,82 (d, J = 6,9 Hz, 1H, H-1"); 5,95 (s, 2H, H-6, 8); 7,03 (d, J = 9,2 Hz, 1H, H-5*'); 7,13 (d, J = 8,6 Hz, 1H, H- 5'); 7,16 (m, 1H, H-6'); 7,305 (d, J = 1,7 Hz, 1/2H, H-2'); 7,309 (d, J = 1,7 Hz, 1/2H, H-2'); 7,68 (đ, J = 1,7; 6,9 Hz, 1H, H-6*'); và 7,69 (s, 1H, H-2*'). 13C NMR (CD3OD) δ 62,4 (C-6"); 71,3 (C-4"); 74,8 (C-2"); 77,5 (C-5"); 78,3 (C- 3"); 92,0 (C-3); 97,3 (C-8); 98,1 (C-6); 101,2 (C-4a); 101,5 (C-2); 103,5 (C-1"); 117,2 (C-5'); 117,5 (C-2'); 118,5 (C-2*'); 119,8 (C-5*'); 121,1 (C-6'); 125,9 (C- 6*'); 126,5 (C-1*'); 130,5 (C-1'); 141,6 (C-3*'); 146,5 (C-4*'); 147,6 (C-3'); 147,9 (C-4'); 160,9 (C-8a); 165,4 (C-5); 169,1 (COOH); 169,8 (C-7); và 189,3 (C-4).
¾5: Chất rắn màu nâu-đỏ; [α]24D +5,8 (c 0,29, methanol); UV (methanol) λ max (log ε) 291 nm (4,32); ESIMS (negative) m/z 453,10 ([M − H]−, 30%); 299,05 ([C15H7O7]−, 100); APCIMS (positive) m/z 455,10 ([M + H]+, 10%); 303,05 ([C15H11O7]+, 100); APCIMS (negative) m/z 453,25 ([M − H]−, 5%); 301,05 ([C15H9O7]−, 100); 1H NMR (CD3OD) δ 5,94 (s, 1H, H-6); 5,95 (s, 1H, H-8); 6,70 (d, J = 8,4 Hz, 1H, H-5'); 7,02 (d, J = 9,2 Hz, 1/2H, H-5*'); 7,05 (đ, J = 2,6; 8,4 Hz, 1H, H-6'); 7,11 (d, J = 8,4 Hz, 1/2H, H-5*'); 7,23 (d, J = 2,2 Hz, 1/2H, H-2'); 7,24 (d, J = 1,8 Hz, 1/2H, H-2'); 7,60 (d, J = 1,8 Hz, 1H, H- 2*'); 7,68 (đ, J = 1,8; 8,3 Hz, 1/2H, H-6*'); và 7,70 (đ, J = 1,8; 9,2 Hz, 1/2H,
H-6*'). 13C NMR (CD3OD) δ 90,4 và 90,7 (C-3); 96,0 (C-8); 96,6 (C-6); 99,9 (C-4a); 100,4 và 100,6 (C-2); 114,1 (C-5'); 115,4 (C-2'); 116,7 và 117,0 (C-2*'); 118,5 và 118,8 (C-5*'); 119,9 (C-6'); 124,2 (C-6*'); 124,4 (C-1*'); 125,3 (C-1'); 140,3 và 140,7 (C-3*'); 144,4 (C-3'); 144,7 and 145,1 (C-4*'); 146,7 (C-4'); 159,7 (C-8a); 164,0 (C-5); 168,1 (COOH); 168,4 (C-7); và 188,2 và 188,4 (C-4). ¾Quercetin;[2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,5,7-trihydroxy-4H-1-
benzopyran-4-one, 6]: chất rắn màu vàng; [α] 24D +51.5 (c 0.39, methanol); UV (methanol) λ max (log ε) 255 (4,36) và 371 nm (4,33); ESIMS (positive) m/z
325,10 ([M + Na]+, 100%); 303,30 ([M + H]+, 10); ESIMS (negative) m/z
301,05 ([M − H]−, 100%); APCIMS (positive) m/z 303,10 ([M + H]＋
, 100%); APCIMS (negative) m/z 301,05 ([M − H]−, 100); 1H NMR (CD3OD) δ 6,18 (s, 1H, H-6); 6,39 (s, 1H, H-8); 6,88 (d, J = 8.4 Hz, 1H, H-5'); 7,63 (d, J = 8.1 Hz, 1H, H-6'); và 7,74 (s, 1H, H-2'). 13C NMR (CD3OD) δ 94,4 (C-8); 99,3 (C-6); 104,5 (C-4a); 116,0 (C-2'); 116,3 (C-5'); 121,7 (C-6'); 124,2 (C-1'); 137,3 (C-3); 146,2 (C-3'); 148,0 (C-2); 148,8 (C-4'); 158,2 (C-8a); 162,5 (C-5); 165,6 (C-7); và 177,4 (C-4). ¾1a-[4-(β-D-Glucopyranosyl)-3-hydroxyphernyl]-1a,7a-dihydro-4,6- dihydroxy-7a-[2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,5,7-trihydroxy-4-oxo-4H-1- benzopyran-8-yl]-7H-oxireno[b][1]benzopyrane-7-one (7): chất rắn màu vàng; [α] 24D +73,6 (c 0,40, methanol); UV (methanol) λ max (log ε) 254 (4,50), 304 (4,46), và 371 (4,34); ESIMS (positive) m/z 787,15 ([M + Na]+, 40%), 765,15 ([M + H]+, 100), ESIMS (negative) m/z 763,05 ([M − H]−, 100%); 1H NMR (CD3OD) δ 3,43 (m, 1H, H-4"); 3,54 (m, 3H, H-2", 3", 5"); 3,77 (đ, J = 5,7; 12,0 Hz; 2/3H, H-6"a); 3,79 (đ, J = 6,3; 12,0 Hz, 1/3H, H-6"a); 4,04 (đ, J = 2,3; 12,0 Hz, 1/3H, H-6"b); 4,05 (đ, J = 2,3; 12,0 Hz, 2/3H, H-6"b); 4,85 (d, J = 7,4 Hz, 1/3H, H-1"); 4,87 (d, J = 7,4 Hz, 2/3H, H-1"); 5,98 (s, 1H, H- 6*); 6,03 (s, 1H, H- 8*); 6,25 (đ, J = 2,3; 8,6 Hz, 1/3H, H-6'); 6,33 (đ, J = 2,3; 8,6 Hz, 2/3H, H-6'); 6,42 (s, 1H, H-6 ); 6,816 (d, J = 8,6 Hz, 1/3H, H-5*'); 6,820 (d, J = 8,6 Hz, 2/3H, H-5*'); 6,86 (đ, J = 2,3; 8,6 Hz, 1/3H, H-6*'); 6,87 (đ, J =
2,3; 8,0 Hz, 2/3H, H-6*'); 6,97 (d, J = 1,7 Hz, 2/3H, H-2*'), 6,99 (d, J = 1,7 Hz, 1/3H, H-2*'); 7,00 (d, J = 8,6 Hz, 2/3H, H-5'); 7,04 (d, J = 8,6 Hz, 1/3H, H-5'); 7,76 (d, J = 1,7 Hz, 2/3H, H-2'); và 7,78 (d, J = 2,3 Hz, 1/3H, H-2'). 13C NMR (CD3OD) δ 62,62 và 62,73 (C-6"); 71,44 và 71,57 (C-4"); 74,8 (C-2"); 77,58 và 77,63 (C-5"); 78, 26 và 78,46 (C-3"); 93,67 và 93,71 (C-2*); 95,6 (C-6); 96,4 (C-8*); 97,8 (C-6*); 100,3 (C-4a*); 103,21 và 103,66 (C-1"); 104,4 (C-3*); 106,3 (C-4a); 108,74 và 108,78 (C-8); 116,00 và 116,08 (C-5*'); 116,94 và 117,03 (C-2*'); 117,25 và 117,35 (C-5'); 117,35 và 117,44 (C-2'); 120,69 và 120,74 (C-6*'); 120,86 và 120,91 (C-6'); 126,9 (C-1'); 127,2 (C-1*'); 138,2 (C- 3); 146,17 và 146,22 (C-3*'); 146,93 và 146,98 (C-2); 146,99 và 147,04 (C-4*'); 147,33 và 147,39 (C-3'); 148,20 và148,40 (C-4'); 153,2 (C-8a); 164,3 (C-8a*); 165,7 (C-5); 166,5 (C-5*); 167,59 và 167,64 (C-7); 170,5 (C-7*); 177,7 (C-4); và 186,9 (C-4*). ¾5a-[4-(β-D-Glucopyranosyl)-3-hydroxyphernyl]-5a,11a-dihydro- 1,3,11a-trihydroxy-9-(3,5,7-trihydroxy-4-oxo-4H-1-benzopyran-2-yl)-12H- [1]benzopyrano[2,3-b][1,4]benzodioxin-12-one (8): chất rắn màu nâu-đỏ; [α] 24D +32.5 (c 0,46, methanol); UV (methanol) λ max (log ε) 269 (4,45); 301 (4,51); và 360 nm (4.41); ESIMS (positive) m/z 787,25 ([M + Na]+, 100%); 555,90 ([C22H14O11]+, 25); 487,15 ([C21H20O12 + Na]+, 25); ESIMS (negative) m/z
763,10 ([M − H]−, 85%); 299,00 ([C15H10O7]−, 100). 1H NMR (CD3OD) δ 3,40 (m, 1H, H-4"); 3,43 (m, 1H, H-5"); 3,48 (m, 1H, H-3"); 3,50 (m, 1H, H-2"); 3,70 (đ, J = 5,2; 12,0 Hz, 1H, H-6"a); 3,93 (d, J = 12,0 Hz, 1H, H-6"b); 4,84 (d, J = 6,9 Hz, 1H, H-1"); 5,96 (s, 1H, H-6); 5,98 (s, 1H, H-8); 6,18 (s, 1H, H-6*); 6,39 (s, 1H, H-8*); 7,14 (d, J = 8,6 Hz, 1H, H-5'); 7,18 (m, 1H, H-6'); 7,19 (d, J = 8.6 Hz, 1H, H-5*'); 7,328 (d, J = 2,9 Hz, 1/2H, H-2'); 7,333 (d, J = 2,3 Hz, 1H, H- 2'); 7,87 (d, J = 8.6 Hz, 1H, H-6*'); và 7,88 (s, 1H, H-2*'). 13C NMR (CD3OD) δ 62,4 (C-6"); 71,3 (C-4"); 74,8 (C-2"); 77,5 (C-5"); 78,2 (C-3"); 91,8 (C-3); 94,6 (C-8*); 97,4 (C-8); 98,1 (C-6); 99,4 (C-6*); 101,2 (C-4a); 101,7 (C-2); 103,4 (C-1"); 104,6 (C-4*a); 117,2 (C-5'); 117,5 (C-5*'); 117,5 (C-2'); 118,2 (C-2*'); 121,1 (C-6'); 123,5 (C-6*'); 127,4 (C-1*'); 130,6 (C-1'); 138,1 (C-3*); 142,1 (C- 3*'); 143,3 (C-4*'); 146,3 (C-2*); 147,6 (C-3'); 147,9 (C-4'); 158,2 (C-8*a);
161,0 (C-8a); 162,5 (C-5*); 165,4 (C-5); 165,8 (C-7*); 169,8 (C-7); 177,4 (C- 4*); 189,7 (C-4).
¾5a-(3,4-Dihydroxyphenyl)-5a,11a-dihydro-1,3,11a-trihydroxy-9- (3,5,7-trihydroxy-4-oxo-4H-1-benzopyran-2-yl)-12H-[1]benzopyrano[2,3- b][1,4]benzodioxin-12-one (9): chất rắn màu vàng; [α] 24D –2,9 (c 0,51;