M Ở ĐẦU
3.1.2.5. Nghiên cứu lựa chọn các điều kiện công nghệ trích ly thích hợ p
Để lựa chọn tỷ lệ NL/DM thích hợp, chúng tôi khảo sát các tỷ lệ: 1/16, 1/18, 1/20 và 1/22. Mỗi mẫu thí nghiệm có khối lượng nguyên liệu: 50g với hàm lượng flavonoid tổng là 2,52%. Các kết quả thí nghiệm được thể hiện ở bảng 3.8.
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của tỷ lệ NL/DM đến hiệu suất trích ly
Hiệu suất trích ly flavonoid, % Tỷ lệ NL/DM,
m/v
Lượng flavonoid
tổng thu được, g So với tổng lượng chất khô So với flavonoid trong nguyên liệu 1/16 0,894 1,94 77,08 1/18 0,920 2,00 79,33 1/20 0,961 2,08 82,85 1/22 0,962 2,09 82,96
Kết quả ở bảng 3.8 cho thấy tỷ lệ NL/DM thích hợp nhất là 1/20 vì khi lượng dung môi tăng lên (tỷ lệ NL/DM là 1/22) thì hiệu suất trích ly và thu nhận các hợp chất flavonoid tăng lên không nhiều so với chi phí sản xuất. Vì vậy, chúng tôi lựa chọn tỷ lệ NL/DM là 1/20 cho các thí nghiệm tiếp theọ
b. Nghiên cứu ảnh hưởng của số lần trích ly đến hiệu suất trích ly
Chúng tôi tiến hành trích ly với số lần trích ly khác nhau: 1, 2 và 3 lần để lựa chọn số lần trích ly thích hợp nhất sao cho vừa đạt hiệu suất trích ly cũng như thu nhận các hợp chất flavonoid. Mỗi mẫu thí nghiệm có khối lượng nguyên liệu: 50g với hàm lượng flavonoid tổng là 2,52%. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.9.
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của số lần trích ly đến hiệu suất trích ly
Hiệu suất trích ly flavonoid, % Số lần trích ly Ltổượng thu ng flavonoid được, g So với tổng lượng
chất khô So với flavonoid trong nguyên liệu 1 0,903 1,96 77,93 2 0,961 2,08 82,85 3 0,968 2,10 83,46 Các kết quả thí nghiệm cho thấy số lần trích ly càng nhiều thì hiệu suất trích ly càng tăng, tuy nhiên khi tăng số lần lên 3 lần thì hiệu suất trích ly cũng
không tăng lên nhiềụ Vì vậy, chúng tôi lựa chọn trích ly 2 lần cho các thí nghiệm tiếp theọ
c. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian trích ly đến hiệu suất trích ly
Theo lý thuyết, thời gian trích ly càng dài thì hiệu suất thu nhận sản phẩm càng tăng, nhưng đến một ngưỡng thời gian nhất định thì lượng sản phẩm thu được tăng thêm không đáng kể, đồng thời có thể ảnh hưởng xấu đến chất lượng sản phẩm. Do vậy, cần xác định thời gian trích ly thích hợp cho từng loại nguyên liệu và sản phẩm. Các mức tổng thời gian trích ly cần khảo sát 6, 8, 10, 12 giờ. Mỗi mẫu thí nghiệm có khối lượng nguyên liệu: 50 g với hàm lượng flavonoid tổng là 2,52%. Kết quả khảo sát về thời gian trích ly được ghi ở bảng 3.10.
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất trích ly
Hiệu suất trích ly flavonoid, % Thời gian, h Ltổượng thu ng flavonoid được, g So với tổng lượng
chất khô So với flavonoid trong nguyên liệu 6 0,903 1,96 77,93 8 0,961 2,08 82,85 10 0,976 2,12 84,14 12 0,979 2,13 84,48
Kết quả ở bảng 3.10 cho thấy thời gian trích ly cho hiệu quả cao nhất là 10 và 12 giờ, nhưng xét về hiệu quả kinh tế chúng tôi chọn thời gian trích ly với tổng thời gian 2 lần là 10 giờ.
d. Nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ khuấy trộn đến hiệu suất trích ly
Trong phần nghiên cứu lựa chọn phương pháp trích ly các chất flavonoid, chúng tôi đã lựa chọn phương pháp trích ly động là phương pháp thích hợp nhất. Tốc độ khuấy trộn cũng ảnh hưởng lớn đến hiệu suất trích ly và hàm lượng flavonoid. Chúng tôi tiến hành khảo sát với các tốc độ khuấy trộn khác nhau: 200, 300, 400 và 500 v/ph. Mỗi mẫu thí nghiệm có khối lượng nguyên liệu: 50g với hàm lượng flavonoid tổng là 2,52%. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.11.
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của tốc độ khuấy trộn đến hiệu suất trích ly
Hiệu suất trích ly flavonoid, % Tốc độ khuấy,
v/ph
Lượng flavonoid
tổng thu được, g So với tổng lượng chất khô So với flavonoid có trong nguyên liệu 200 0,923 2,00 79,61 300 0,976 2,12 84,14 400 0,974 2,11 83,98 500 0,967 2,10 83,42
Từ kết quả thu được, chúng tôi lựa chọn tốc độ khuấy trộn thích hợp nhất là 300 v/ph.
ẹ Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly đến hiệu suất trích ly
Ta biết rằng, nhiệt độ trích ly là yếu tố có ảnh hưởng rất lớn đến quá trình trích lỵ Thông thường nhiệt độ trích ly càng cao sẽ càng làm cho độ xốp của nguyên liệu tăng lên và các HCSH sẽ linh động hơn, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình trích lỵ Nhưng khi nhiệt độ tăng quá cao có thể gây ra các biến đổi hoá học của các thành phần có trong nguyên liệu, dẫn đến chất lượng của sản phẩm bị thay đổi, thường là theo chiều hướng xấụ Do vậy, tùy thuộc vào từng loại nguyên liệu cần lựa chọn nhiệt độ thích hợp nhất. Các mức nhiệt độ trích ly cần khảo sát 40, 50, 60, 70oC. Mỗi mẫu thí nghiệm có khối lượng nguyên liệu: 50g với hàm lượng flavonoid tổng là 2,52%. Kết quả khảo sát về nhiệt độ trích ly được ghi ở bảng 3.12. Bảng 3.12. Ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly đến hiệu suất trích ly Hiệu suất trích ly flavonoid, % Nhiệt độ trích ly, oC Lượng flavonoid
tổng thu được, g So với tổng lượng chất khô So với flavonoid có trong NL 40 0,866 1,88 74,62 50 0,943 2,05 81,33 60 0,976 2,12 84,14 70 0,980 2,13 84,48
Qua bảng kết quả 3.12 ta thấy khi nhiệt độ trích ly càng tăng thì hiệu suất thu nhận flavonoid càng tăng nhưng từ 60oC trở đi, hiệu suất thu nhận tăng không đáng kể. Xét về mặt kinh tế và chất lượng sản phẩm, chúng tôi lựa chọn nhiệt độ thích hợp nhất cho quá trình trích ly các flavonoid từ vỏ hành là 60oC.
Tóm lại, chúng tôi đã lựa chọn được điều kiện công nghệ thích hợp nhất để trích ly các hợp chất flavonoid từ vỏ hành, đó là phương pháp trích ly động với các thông số: độ mịn 2 < d ≤ 3 mm; dung môi trích ly EtOH 95%; tỷ lệ nguyên liệu/dung môi: 1/20; nhiệt độ trích ly: 60oC; thời gian trích ly: 10 giờ; số lần trích ly: 2 lần; tốc độ khuấy trộn: 300 v/ph. Với điều kiện trích ly trên sẽ thu được cao chiết flavonoid với hiệu suất thu nhận flavonoid 84,14% so với hàm lượng flavonoid có trong nguyên liệụ Tuy nhiên, hàm lượng flavonoid trong cao chiết còn thấp (19,21%), còn chứa nhiều hợp chất không mong muốn thu được từ quá trình trích lỵ Vì vậy, cao chiết cần phải đem tinh chế để thu nhận sản phẩm flavonoid tinh sạch từ vỏ hành.
3.1.2.6. Nghiên cứu công nghệ làm sạch các chất flavonoid từ cao chiết vỏ hành
ạ Kết quả nghiên cứu lựa chọn phương pháp làm sạch
Từ kết quả nghiên cứu tách các chất flavonoid ở mục 3.1.1.2. chúng tôi lựa chọn phương pháp làm sạch cao chiết flavonoid như sau:
Cao chiết flavonoid được tách bằng cột sắc ký hấp phụ chất nhồi cột nhựa hấp phụ Amberlite XAD-2 của Sigma-Aldric Cọ, được làm bằng inox có kích thước 30xØ6 cm. Nguyên liệu cao chiết flavonoid được cho vào cột với tỷ lệ NL/gel là 1/30 (m/m) để qua 24 giờ để nguyên liệu hấp phụ vào gel, sau đó rửa giải bằng hệ dung môi là H2O và EtOH. Trước hết cột được rửa giải bằng dung môi H2O với tỷ lệ H2O /flavonoid thô là 30/1(v/v) để loại bỏ đường và axit và các chất tan trong nước, tiếp theo rửa với dung môi EtOH với tỷ lệ EtOH /flavonoid thô 50/1 (v/v) để thu nhận các chất flavonoid thô. Tốc độ rửa giải là 50ml/phút. Phân đoạn EtOH đem cô đuổi dung môi thu được flavonoid thô. Flavonoid thô được phân tích xác định hàm lượng flavonoid tổng cho kết quả hàm lượng flavonoid là 38,16% (381,6 mg quercetin/g flavonoid thô), đồng thời phân tích bằng HPLC cho kết quả giống mục 3.1.1.3, chứng tỏ rằng thành phần
trong flavonoid thô gồm có quercetin, 2 phân tử quercetin, 3 phân tử quercetin, và các dẫn xuất của chúng ở dạng glucoside (- 4'-O-β-D-glucopyranoside, ngoài ra vẫn còn một số chất khác như protocatechuic acid. Để thu nhận quercetin có độ tinh khiết cao, flavonoid thô cần được tiếp tục tinh chế.
b. Kết quả nghiên cứu lựa chọn hệ dung môi làm sạch
Flavonoid thô sau khi cô đặc tiếp tục được tinh chế để tách thành phần chính là quercetin. Công nghệ làm sạch quercetin được thực hiện bằng phương pháp kết tinh như sau: hòa tan flavonoid trong EtOH, đun nóng dung dịch EtOH có chứa flavonoid thô đến nhiệt độ 80oC để quercetin tan hoàn toàn, sau đó kết tinh quercetin bằng cách nhỏ dung môi H2O đã được làm lạnh để tạo mầm kết tinh. Sau đó làm lạnh đến 10oC trong 24 giờ để kết tinh hết, lọc rửa kết tinh thu được quercetin tinh sạch.
Các yếu tố công nghệ cần khảo sát là tỷ lệ flavonoid thô/dung môi EtOH để hòa tan flavonoid thô, và tỷ lệ H2O/EtOH chứa flavonoid để quá trình kết tinh quercetin đạt hiệu suất cao nhất.
+ Kết quả nguyên cứu lựa chọn tỷ lệ flavonoid thô /dung môi EtOH Để hòa tan hoàn toàn flavonoid thô. Tỷ lệ flavonoid thô/dung môi EtOH được khảo sát là: 1/2, 1/3, 1/4, 1/5, 1/6. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.13.
Bảng 3.13. Ảnh hưởng của tỷ lệ flavonoid thô/EtOH đến quá trình hòa tan flavonoid
Flavonoid thô/ EtOH (m/v) Nhận xét
1/2 Không tan
1/3 Tan ít
1/4 Tan ít
1/5 Tan hết
1/6 Tan hết
Từ bảng 3.13 cho thấy, tỷ lệ flavonoid thô/EtOH hòa tan hết flavonoid thô là 1/5 và 1/6. Để thuận lợi cho quá trình kết tinh sau này, tỷ lệ flavonoid thô/ EtOH lựa chọn là 1/5.
+ Kết quả nghiên cứu lựa chọn tỷ lệ H2O/EtOH thích hợp: 10 g hoạt chất flavonoid thô với độ tinh khiết 38,16%, được hòa tan trong 50 ml EtOH rồi tiến hành kết tinh quercetin với tỷ lệ dung môi H2O/EtOH ở các mức: 1/5, 1/4, 1/3, 1/2, 1/1, 2/1. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.14.
Bảng 3.14. Ảnh hưởng của tỷ lệ H2O/EtOH đến quá trình kết tinh
Tỷ lệ H2O/EtOH, v/v Độ tinh khiết sản phẩm, % Hiệu suất kết tinh, % Hiệu suất thu nhận sản phẩm, % 1/5 84,36 63,64 28,79 1/4 85,24 67,56 30,24 1/3 86,20 72,57 32,13 1/2 86,23 83,22 36,82 1/1 86,48 89,88 39,66 2/1 86,40 83,25 52,47
Như vậy, tỷ lệ H2O/ EtOH cho hiệu quả kết tinh flavonoid cao nhất là 1/1 vì nếu tăng lên 2/1 thì flavonoid kết tinh sẽ tan lại trong dung môị Nếu tỷ lệ H2O/ EtOH nhỏ hơn 1/2 thì flavonoid không kết tinh được hết vẫn còn trong dung dịch. Sản phẩm có độ tinh khiết là 86,48%.
Sản phẩm flavonoid có độ tinh khiết 86,48% đạt tiêu chuẩn của đề tàị Tuy nhiên có thể tăng độ tinh khiết bằng cách tách trên hệ phân tách cột đồng bộ Flash 150 Binary system điều kiện tách: cột ODS-C18 kích thước 250xØ20 mm, dung môi MeOH/H2O (20:80; v/v) vận tốc dòng chảy 10-20 ml/phút, UV= 280 nm. Sản phẩm được phân lập qua hệ thống thiết bị này thường có độ tinh khiết ≥ 95%.
Từ các nghiên cứu phân tích và xử lý nguyên liệu, lựa chọn dung môi và phương pháp trích ly, lựa chọn các điều kiện công nghệ trích ly thích hợp, lựa chọn hệ dung môi làm sạch và phương pháp làm sạch, có thể rút ra quy trình công nghệ trích ly và làm sạch các chất flavonoid từ vỏ hành được thể hiện trên sơ đồ 3.1.
Sơđồ 3.1. Sơđồ quy trình công nghệ sản xuất các chất flavonoid từ vỏ hành trên qui mô phòng thí nghiệm
Bã vỏhành Xử lý nguyên liệu Sấy khô to=60oC (W 8-10%) Xay ( 2 < d 3 mm) Dịch trích ly Trích ly
- Dung môi EtOH 95% - Số lần TL: 2 lần (1/12;1/8) - Tỷ lệ NL/DM: 1/20 -Tốc độ khuấy: 300 vòng/phút - Thời gian: 5 giờ/lần - Nhiệt độ TL: 60oC Vỏ củ hành EtOH 95%
Cô đuổi dung môi
Sắc ký cột XAD-2 (30x 6 cm)
- H2O/flavonoid: 30/1; EtOH/flavonoid: 50/1
Kết tinh, 10oC, 24h Phân đoạn EtOH
Cao chiết Flavonoid
Sản phẩm Flavonoid tinh sạch
H2O, EtOH
Phân đoạn H2O
Mô tả quy trình công nghệ sản xuất các chất flavonoid từ vỏ hành quy mô phòng thí nghiệm (sơđồ 3.1):
Vỏ hành được sấy khô ở nhiệt độ 60oC đến khi đạt độ ẩm 8%, xay đến độ mịn 2 < d 3 mm. Trích ly bằng EtOH 95% với tỷ lệ nguyên liệu so với dung môi 1/20 (m/v), trích ly 2 lần (theo tỷ lệ lần 1: 1/12; lần 2: 1/8), nhiêt độ trích ly 60oC và tổng thời gian 2 lần trích ly là 10 giờ. Trong quá trình trích ly, nguyên liệu và dung môi được đảo trộn bằng cánh khuấy với tốc độ là 300 vòng/phút, lọc bỏ bã cô đuổi dung môi thu được cao chiết flavonoid. Cao chiết flavonoid được làm sạch bằng sắc ký cột Amberlite XAD-2 (30xØ6 cm) với hệ dung môi rửa giải là nước và EtOH, tỷ lệ H2O/cao chiết flavonoid và EtOH/cao chiết flavonoid theo thứ tự 30/1(v/v) và 50/1 (v/v). Phân đoạn EtOH sau khi qua cột được cô đuổi dung môi thu được flavonoid thô với hàm lượng flavonoid 38,16%. Để thu nhận quercetin tinh sạch, flavonoid thô được hòa tan trong cồn với tỷ lệ flavonoid thô/dung môi là 1/5 (m/v), sau đó đun nóng đến nhiệt độ 800C, kết tinh bằng H2O lạnh với tỷ lệ H2O/dung dịch flavonoid trong EtOH 1/1 (v/v), làm lạnh đến 10oC trong 24 giờ để kết tinh hết, lọc rửa kết tinh thu được quercetin tinh sạch, lọc sấy khô sẽ nhận được sản phẩm flavonoid sạch có màu vàng với độ tinh khiết 86,48%, hiệu suất thu nhận là 2,18% so với trọng lượng chất khô.
3.2. Kết quả nghiên cứu về các hợp chất flavonoid có trong vỏ quả citrus
3.2.1. Nghiên cứu xác định thành phần và cấu trúc của các hợp chất flavonoid có trong vỏ quả citrus
3.2.1.1. Xác định thành phần các chất flavonoid có trong vỏ quả citrus
ạ Khảo sát nguyên liệu vỏ quả citrus: Quả citrus có ở miền Nam gồm có chanh, quất, cam, bưởi, quýt. Mỗi loại quả được dùng vào mục đích khác nhaụ Quýt thường được tiêu thụ theo dạng ăn tươị Chanh được tiêu thụ quả tươi hoặc chế biến các dạng sản phẩm khác như chanh muối nguyên quả hay cắt sợị Quất được dùng trong một số nhà máy ép dịch quả xuất khẩu Bến Tre, sau đó vỏ quất được thu hồi dùng cho sản xuất sản phẩm quít sợị Cam, bưởi: thu hoạch quanh năm, phân bố rộng rãi ở nhiều vùng khác nhau: Đồng Tháp, Biên Hòa, Vĩnh Long, Tiền Giang… Dùng để ép lấy dịch quả xuất khẩụ Nhiều nhà máy ép dịch quả dùng cam, bưởi, để chế biến nước quả hoặc xuất khẩu trực tiếp (Bến Tre, Tiền Giang, …), lượng vỏ thải ra rất nhiều, riêng nhà máy chế biến rau quả Tiền Giang, trung bình mỗi tháng tổng lượng vỏ cam, bưởi thải ra lên đến hơn 10 tấn, hiện chưa được sử dụng - đây là nguồn nguyên liệu rất dồi dào có thể tận dụng để khai thác flavonoid. Vì vậy, vỏ cam và bưởi được lựa chọn làm nguồn nguyên liệu chính trong đề tài nghiên cứu khai thác các hợp chất flavonoid.
b. Phân tích đánh giá chất lượng nguyên liệu vỏ quả citrus:
Vỏ cam, bưởi sau khi thu nhận về, được phân tích sơ bộ thành phần hóa học. Kết quả phân tích được trình bày ở bảng 3.15.
Bảng 3.15. Thành phần hóa học của vỏ cam và bưởi
Hàm lượng tính theo tổng lượng chất khô, % Nguyên liệu Độẩm,
% Protein Glucid Xelluloza Tro Pectin Tinh
dầu Flavonoid tổng Xanh 62,6 1,83 13,04 19,16 2,57 12,7 1,75 2,65 Vỏ cam Vàng 76,9 0,78 9,31 12,25 0,59 6,05 0,20 4,78 Xanh 78,8 1,45 6,90 10,20 1,04 3,05 1,5 4,03 Vỏ bưởi Trắng 84,5 0,86 6,78 7,08 0,67 3,77 0,15 4,12
Qua kết quả phân tích cho thấy, hàm lượng pectin, glucid, xelullo, tinh dầu đều cao và khác nhau, điều này sẽ gây ảnh hưởng đến quá trình trích ly, gặp khó khăn cho quá trình tinh sạch. Hàm lượng flavonoid tổng của các loại vỏ họ