M Ở ĐẦU
1.4. Flavonoid trong chè
1.4.1. Giới thiệu chung về cây chè
Cây chè hay cây trà có tên khoa học là Camellia sinensis Ọ Kuntze thuộc họ chè Theaceae. là loài cây mà lá và chồi của chúng được sử dụng để sản xuất chè (trà uống). Chè có nguồn gốc ở khu vực Đông Nam Á, nhưng ngày nay được trồng phổ biến ở nhiều nơi trên thế giới, trong các khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đớị Chè là loại cây xanh lưu niên mọc thành bụi hoặc các cây nhỏ, thông thường được xén tỉa để thấp hơn 2 mét khi được trồng để lấy lá; có rễ cái dàị Hoa chè màu trắng ánh vàng, đường kính từ 2,5–4 cm, với 7 - 8 cánh hoạ Hạt chè có thể ép để lấy dầụ Chè xanh, chè ô long và chè đen tất cả đều được chế biến từ loài này, nhưng được chế biến ở các mức độ ôxi hóa khác nhau [1, 3, 6].
1.4.2. Thành phần hóa học của chè
Lá chè tươi có khoảng 70% là nước, 20% tanin (hỗn hợp catechin và dẫn xuất của chúng), 2-3,5% cafein, pectin 3-5%, còn lại là các chất khoáng, xơ, lignan và tinh dầu (0,07-0,21%). Thuật ngữ polyphenol (tanin thực vật) dùng để chỉ các hợp chất phenolic chuyển hóa thứ cấp phân bố rộng rãi trong thực vật. Mặc dù trong các bộ phân của chè người ta đã tìm ra hơn 60 cấu trúc hóa học khác nhau của các polyphenol, nhưng chúng đều được cấu tạo từ 3 nhân cơ bản là flavan-3-ol (catechin) (1), ester gallol (2) và hexahydroxydiphenol (3) [1, 3, 6, 18, 20].
Trong cây chè polyphenol phân bố chủ yếu ở lá và có hàm lượng thay đổi theo độ tuổi của chè. Polyphenol tập trung nhiều nhất ở trong các búp chè non với hàm lượng từ 30-32% và giảm dần ở các lá già. Lá thứ 2 tính từ búp xuống có hàm lượng polyphenol 25-28% ; lá thứ 3 có 20-22%, lá thứ 4 có 16-18%, lá già 10-13% và trong cuộng chè chỉ có 15% polyphenol tính theo trọng lượng mẫu khô [1, 3, 6, 9].
Hình 1.11. Cấu trúc hóa học của các chất chínhcatechin, flavonols và flavones có trong chè
1.4.3. Tác dụng sinh học của chè
Chè là loại đồ uống phổ biến trên thế giớị Ngoài tác dụng làm giảm cơn khát, chè còn có rất nhiều tác dụng có ích đối với sức khỏe con ngườị Người Trung Quốc biết uống chè từ năm 2700 trước công nguyên, nhưng phải đến năm 1600 sau công nguyên theo các con đường thương mại và truyền giáo, chè mới được du nhập vào châu Âu [6, 10, 20]. Chè có tác dụng hỗ trợ chống ung thư phổi do hút thuốc, chống nhiễm phóng xạ, chống oxy hóa, ngăn ngừa bệnh huyết áp thấp, làm giảm lượng đường trong máụ Hiện nay, trên thế giới có rất nhiều
những công trình nghiên cứu tác dụng của chè, trong đó hợp chất flavonoid trong chè đóng vai trò rất quan trọng [20, 45, 46].
Một số nghiên cứu cho thấy epicatechin và epigallocatechin gallat có tác dụng phòng chống bệnh ung thư tuyến tiền liệt, ngăn ngừa phát triển của khối u và dẫn đến làm giảm khả năng di căn. Epigallocatechin gallat làm giảm kích thước của khối u và đó là nguyên nhân khiến bệnh ung thư được thuyên giảm. Hơn nữa epigallocatechin gallat còn có tác dụng ức chế urokinase là loại enzym thường tìm thấy trong nước tiểu của phần lớn những người mắc bệnh ung thư. Urokinase bẻ gãy liên kết cơ bản nhân tế bào làm cho khối u phát triển nhanh và bệnh sẽ di căn [24, 45, 49, 58].
Koo, M. W và đồng nghiệp cũng làm thí nghiệm so sánh giữa các catechin trong chè xanh với amilorid – một loại thuốc lợi tiểu nhẹ dùng để điều trị cao huyết áp, xung huyết tim nhẹ và có tác dụng ức chế urokinasẹ Kết quả cho thấy, để có hiệu quả điều trị ngang nhau, người bệnh phải dùng amilorid với liều lượng 20 mg/ngày trong khi với chè thì chỉ cần một tách nhỏ, chè chứa 150 mg epigallocatechin gallat [49].
Ngoài ra một vài nghiên cứu khác đã chứng tỏ rằng các catechin epigallocatechin, epicatechin gallat và epigallocatechin gallat được chiết xuất từ chè xanh - Camella sinensis L, có tác dụng ức chế, gây miễn dịch với vi rút HIV, IC50 của epigallocatechin là 7,8; của epicatechin gallat là 0,32 và của epigallocatechin gallat là 0,63µmol [10, 85].
Ngoài tác dụng chữa bệnh, các polyphenol từ dịch chiết chè xanh còn được sử dụng trong mỹ phẩm. Chúng có tác dụng làm ẩm da và chống các nếp nhăn. Polyphenol có trong thuốc đánh răng có tác dụng diệt khuẩn. Những thuốc có chứa catechin và các dẫn xuất của nó chống lại sự phát triển của vi khuẩn gây viêm lợi và chất collagen của vi sinh vật nàỵ Catechin ở nồng độ 100mg/ml ức chế được 98% collagen [3, 6, 12].
Do chè có rất nhiều tác dụng đối với con người, là một loại sản phẩm không gây độc, nên các nghiên cứu về chè nhằm ứng dụng trong các ngành công
nghiệp thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm ngày càng được quan tâm và phát triển.
Nghiên cứu gần đây tại Anh cho thấy polyphenol trong chè xanh, trong đó thành phần chính là epigallocatechin-3-gallat, có các tác dụng chống sinh đột biến, chống sinh ung thư và kháng viêm [24, 58, 84]. Những nghiên cứu dịch tễ học gợi ý rằng chè xanh có tiềm năng giảm nguy cơ viêm teo dạ dày mãn tính, ung thư dạ dày, ung thư da, bệnh động mạch vành và một số nhiễm khuẩn. Những nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới còn cho thấy: chất polyphenol có trong trà xanh có vai trò quan trọng trong việc phòng chống lại bệnh ung thư. Đặc biệt, chất chống oxy hoá EGCG (epigallotechin gallate) là loại polyphenol vô cùng mạnh mẽ, là nhân tố chủ yếu tạo nên dược tính của chè xanh. Nó có công dụng ngăn ngừa các enzyme kích hoạt sự sao chép nhân bản ở tế bàọ Các nhà khoa học Nhật Bản ở Viện nghiên cứu ung thư Saitama đã khám phá ra rằng những phụ nữ có thói quen uống hơn 5 tách chè xanh mỗi ngày thường ít có nguy cơ mắc bệnh hoặc tái phát bệnh ung thư vú và bệnh không di căn nhanh chóng như những đối tượng bình thường [32, 45,79].
1.4.4. Tình hình sản xuất tiêu thụ chè trên thế giới và ở Việt Nam
1.4.4.1. Tình hình sản xuất tiêu thụ chè trên thế giới
Mỗi năm trên thế giới sản xuất trên 2,5 triệu tấn chè. Trong đó, 80% sản lượng chè là từ các nước châu Á, đặc biệt là Ấn Độ, Trung Quốc và Srilankạ Có thể đưa ra một vài con số làm ví dụ [20, 45, 46]:
Ấn Độ sản xuất từ 684 – 701 nghìn tấn/năm. Trung Quốc sản xuất từ 534 – 545 nghìn tấn/năm. Srilanka sản xuất từ 208 – 288 nghìn tấn/năm
Thị trường tiêu thụ chè cũng rất lớn: Irắc mỗi năm nhập khẩu 60.000 tấn chè (1/3 trong số đó là từ Việt Nam), Nga mỗi năm tiêu thụ 161.000 tấn, Pakistan nhập khẩu 86.000 tấn, Nhật 119.000 tấn.
Chè thương phẩm trên thế giới có 2 loại chính là chè đen và chè xanh. Khác với chè xanh là búp chè sau thu hoạch chỉ được sao và sấy cho khô vàng, chè đen được xử lý trước qua một quá trình lên men để làm giảm vị chát và tanin.
Ngoài những sản phẩm chè thông thường, trên thế giới còn có các loại chè tan và chè không cafein. Phần lớn chè đen, chè tan và chè không cafein được tiêu thụ nhiều ở châu Âu và Bắc Mỹ. Còn chè xanh được tiêu thụ chính ở Đông Á, Nhật, Nga và một số nước Ả Rập [10].
1.4.4.2. Tình hình sản xuất tiêu thụ chè ở Việt Nam
Theo số liệu của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, năm 2009, diện tích trồng chè của Việt Nam sẽ đạt 131,5 nghìn ha, tăng 1.900 ha so với diện tích năm 2007. Năm 2009, kim ngạch xuất khẩu chè của Việt Nam tăng khoảng 40 triệu USD so với năm trước đó, đạt 117 ngàn tấn. Việt Nam hiện có 270 doanh nghiệp làm chè, 75% lượng chè khô làm ra hàng năm được xuất khẩu sang 110 nước và vùng lãnh thổ trên thế giới và Việt Nam hiện đứng thứ 5 thế giới về sản lượng cũng như kim ngạch xuất khẩu chè [6, 8].
Ở nước ta các công trình nghiên cứu về những tác dụng của hợp chất flavonoid có trong chè còn rất hạn chế. Việc tinh chế các chất hữu ích có trong chè vẫn là vấn đề hết sức phức tạp, đòi hỏi công nghệ hiện đại và tốn nhiều tiền bạc, mà điều đó ở nước ta chưa thực sự đáp ứng được. Mới đây có một vài nghiên cứu mang tính chất thăm dò như nghiên cứu của hai tác giả Nguyễn Đặng Dung (khoa Công nghệ thực phẩm – Trường Đại học Nông nghiệp I) và Lê Như Bích (Trường Đại học Đà Lạt) về: “Ảnh hưởng của các điều kiện che phủ khác nhau đến hàm lượng L-theanine, caffeine, và các catechin trong lá chè tươi thuộc hai giống chè Nhật (Yabukita và Sayamakaori) trồng tại vùng New South Wales (Úc).
Nghiên cứu của GS. Hà Duyên Tư và ThS. Vũ Hồng Sơn (Trường Đại học Bách khoa – Hà Nội) về: “Tối ưu hóa quá trình trích ly polyphenol từ lá chè già bằng phương pháp hàm mong đợi” [2].
Hay nghiên cứu của nhóm tác giả Phạm Thành Quân, Nguyễn Hải Hà, Bạch Long Giang (Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG – HCM) và Tống Văn Hằng (Đại học Quốc gia Hồ Chí Minh) về: “Hàm lượng polyphenol tổng, catechin tổng và hoạt tính quét gốc tự do DPPH của một số loại trà xanh trên thị trường Việt Nam”.
Và còn một số những nghiên cứu khác của những tác giả khác, điều đó cho thấy mặc dù trên thế giới đang rất quan tâm và nghiên cứu rộng rãi về những tác dụng của các chất có trong chè. Tuy nhiên, ở Việt Nam những nghiên cứu về chè còn rất hạn chế.
1.4.5. Chiết xuất polyphenol từ chè xanh
Các sản phẩm polyphenol trên thế giới hiện nay vẫn hoàn toàn được sản xuất bằng cách chiết với dung môi hữu cơ. Dựa trên tính chất hóa học đặc trưng của polyphenol là các hợp chất phân cực yếu, hay gặp trong chè xanh dưới dạng các glycosid dễ tan trong nước và các dung môi hữu cơ có độ phân cực cao như ethanol, methanol, hoặc hỗn hợp của chúng với nước nên người ta thường chọn các dung môi này để chiết các polyphenol ở giai đoạn đầu tiên. Kết quả sàng lọc hoạt tính chống ôxy hóa của các dịch chiết cũng cho thấy khi chiết chè xanh bằng các dung môi phân cực cho các sản phẩm có hoạt tính manh hơn so với khi chiết bằng các dung môi có độ phân cực yếu như n-hexan, ete dầu hỏa, ete etylic, hay hỗn hợp của diethyl ether với chloroform, acetone, ethyl acetat. Mặc dầu vậy, trong dịch chiết tồn tại một lượng lớn các hợp chất không mong muốn bị chiết cùng với polyphenol, thêm vào đó các glycosid cũng bị thủy phân khi sử dụng dung môi chiết là dung dịch nước axit [18, 20].
Phần lớn các polyphenol và các aglycol có hoạt tính chống oxy hóa cao đều không hòa tan được trong các dung môi phân cực yếu, nên các dung môi này được dùng để tinh chế polyphenol từ dịch chiết của các dung môi phân cực. Có thể tham khảo một số ví dụ về các công nghệ chiết polyphenol từ chè xanh bằng dung môi hữu cơ dưới đây [18, 20].
Phương pháp của Bronner W.Ẹ và các cộng sự: 100 g lá chè được ngâm chiết ở nhiệt độ phòng bằng một lít hệ dung môi nước/acetone (tỷ lệ 3:2, v/v) trong 12 giờ. Dịch chiết được cô kiệt trong chân không ở 400C. Chiết bằng n- hexan để loại tạp chất. Cuối cùng polyphenol được chiết bằng ethyl acetat, chế phẩm được làm đông khô thành bột mịn. Sản phẩm được phân tích xác định các catechin và cafein bằng các phương pháp sắc ký như sắc ký lỏng cao áp kết nối khối phổ hoặc sắc ký điện di [18].
Các tác giả Xuejun Pan, Guoguang Niu đã so sánh các phương pháp chiết polyphenol bằng soxhlet với các kỹ thuật chiết kết hợp viba và kết hợp siêu âm (xem bảng 1.9).
Bảng 1.9. So sánh lượng polyphenol chiết từ chè xanh theo các kỹ thuật sử dụng viba, siêu âm và soxhlet
Kỹ thuật A B C D
MAE 30 4 77 10 UE 28 3,6 75 10
Soxhlet 28 3,6 72 9
Trong đó: A là % polyphenol so với nguyên liệu ban đầu; B là % cafein so với nguyên liệu ban đầu; C là % polyphenol trong dịch chiết; D là % cafein trong dịch chiết.
MEA là phương pháp chiết có hỗ trợ viba, dung môi ethanol/nước (1:1, v/v), tỷ lệ dung môi/nguyên liệu là 20/1, thời gian tác dụng của vi ba là 4 phút và ngâm tĩnh 90 phút ở 20oC.
UE là phương pháp chiết có hỗ trợ siêu âm, dung môi ethanol/nước (1:1, v/v), tỷ lệ dung môi/nguyên liệu là 20/1, thời gian chiết là 90 phút, nhiệt độ chiết 20 – 40oC.
Soxhlet là chiết hồi lưu trên thiết bị soxhlet trong 45 phút, nhiệt độ chiết 85oC [84].
CHƯƠNG IỊ NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu
- Nguyên liệu vỏ hành: được thu mua từ các cơ sở chế biến hành thái lát sấy khô ở Nam Sách - Hải Dương, Ninh Hiệp- Hà Nộị
- Nguyên liệu vỏ cam, vỏ bưởi: được thu mua từ nhà máy chế biến rau quả Tiền Giang. Tại nhà máy, nước quả được khai thác theo qui trình hình 2.1, gồm vỏ cam xanh, vỏ cam vàng; vỏ bưởi xanh, vỏ bưởi trắng.
- Nguyên liệu phế thải chè: phế thải chè gồm các loại chè cám, chè vụn, cuộng chè khô được thu mua từ các cơ sở chế biến chè ở các vùng Vĩnh Phúc, Thái Nguyên, Phú Thọ, Bắc Cạn,...
2.2. Hoá chất, thiết bị thí nghiệm 2.2.1. Hóa chất: 2.2.1. Hóa chất:
- Ethanol, EtOH (C2H5OH) - Ethyl acetate, EtOAc (C3H8O2) - Methanol, MeOH (CH3OH) - Diclomethane (CH2Cl2) - Acid chlohidric (HCl) - Sodium hydroxide (NaOH) - Acid sulphuric (H2SO4)
70, 80, 95% 99,5% 99,5% 99,5% 6N 0,05N
Hình 2.1: Qui trình khai thác nước ép cam & bưởi.
Quả Cam, bưởi Gọt vỏ Ép Dịch quả Vỏ xanh (vỏ ngoài) Vỏ vàng, trắng (vỏtrong)
- Acid acetic (CH3COOH)
- Natri sunphat khan (Na2SO4 khan) - Aluminium chloride (AlCl3.10H2O) - Sodium nitrite (NaNO2)
- Nước khử ion - Amberlite XAD-2
- Silicagel BW-820MH, 70-200 mesh
Sigma-Aldric Cọ Fuij Silysia Chemical Ltd.,Japan
2.1.2. Thiết bị thí nghiệm
- Thiết bị cô quay Buchi R-114
- Thiết bị tạo chân không Buchi B-168; V500; B-721 - Hệ thống phân tách cột đồng bộ Flash 150 Binary system - Hệ thống thiết bị trích ly, bốc hơi màng mỏng
- Máy HPLC
- Máy cộng hưởng từ hạt nhân - Jasco Ubest-30 UV/Vis - Máy sấy đông khô
- Máy xay STRAUME- USR
- Sàng có đường kính lỗ: 1mm - 5mm
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp phân tích thành phần chính của nguyên liệu
Để lựa chọn loại nguyên liệu thích hợp cho quá trình trích ly các chất flavonoid đạt hiệu suất thu nhận và chất lượng cao, chúng tôi tiến hành xác định hàm lượng các thành phần chính có trong nguyên liệu bao gồm: độ ẩm, flavonoid tổng, tinh bột, xenluloza, đường tổng, protein.
Các phương pháp xác định hàm lượng các thành phần chính của nguyên liệu như sau:
+ Xác định độ ẩm của nguyên liệu bằng phương pháp sấy đến trọng lượng không đổi TCVN 5613-1991
+ Xác định hàm lượng xenluloza theo TCVN 4590 - 88
+ Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Kjeldahl AOAC 991.20 + Định lượng flavonoid trong nguyên liệu
Chiết xuất hợp chất flavonoid : Cân chính xác 10 g nguyên liệu đã được xay nhỏ cho vào bình cầu (V = 250 ml). Thêm vào đó 150 ml MeOH 80%, trích ly hồi lưu trong thời gian 4 h, lọc dịch chiết, cô bớt dung môi, sau đó đưa về thể tích 50 mL dung dịch để phân tích [41, 42].
Xác định hàm lượng flavonoid tổng: bằng phương pháp đo quang dựa trên phản ứng tạo màu của flavonoid. Thêm vào 1ml dịch chiết (chứa các chất flavonoid), 120 µl dung dịch 5% NaNO2, khuấy trong 5 phút, sau đó thêm 120 µl dung dịch 10% AlCl3 lắc đều để yên trong 6 phút, sau đó thêm vào đó 800 µl dung dịch 1M NaOH. Hỗn hợp dung dịch trên được hoà tan thành 4 ml trong dung dịch H2O, để yên trong 10 phút, so màu trên máy quang phổ ở bước sóng 510 nm. Kết quả được so sánh với đường chuẩn và flavonoid tổng được tính theo mg quercetin/ 1g trọng lượng khô. [41,42]
Xây dựng đồ thị chuẩn quercetin: Cân chính xác 50 mg quercetin hoà tan trong 50 ml nước cất được dung dịch quercetin với nồng độ 0,2mg/ml lần lượt