M Ở ĐẦU
3.3.3.5. Nghiên cứu công nghệ làm sạch các chất flavonoid từ cao chiết phế
Tóm lại, chúng tôi đã lựa chọn được điều kiện công nghệ thích hợp nhất để trích ly các hợp chất flavonoid từ phế thải chè, đó là: độ mịn nguyên liệu 1 < d ≤ 2 mm; phương pháp trích ly động; dung môi trích ly EtOH 70%; tỷ lệ nguyên liệu/dung môi: 1/12; nhiệt độ trích ly: 80oC; thời gian trích ly: 2 giờ; số lần trích ly: 2 lần; tốc độ khuấy trộn: 200 v/ph. Với điều kiện trích ly trên sẽ thu được cao chiết flavonoid với hiệu suất thu nhận 84,28% so với hàm lượng flavonoid có trong nguyên liệụ Tuy nhiên, hàm lượng flavonoid trong cao chiết chỉ đạt 48,61% do trong quá trình trích ly thường kéo theo những hợp chất không mong muốn, vì vậy cao chiết cần phải đem tinh chế để thu nhận sản phẩm flavonoid tinh sạch từ phế thải chè.
3.3.3.5. Nghiên cứu công nghệ làm sạch các chất flavonoid từ cao chiết phếthải chè thải chè
ạ Nghiên cứu lựa chọn phương pháp làm sạch
Cao chiết từ phế thải chè còn chứa nhiều các chất hòa tan không phải là các hợp chất flavonoid. Vì vậy, cần tiến hành tinh chế để loại bỏ các tạp chất, nâng cao hàm lượng flavonoid trong cao chiết. Dựa trên kết quả nghiên cứu mục 3.3.1.1 chúng tôi đưa ra phương pháp tinh chế các chất flavonoid từ phế thải chè như sau:
Cao chiết flavonoid từ phế thải chè được hòa tan vào nước sao cho hàm lượng chất khô đạt 10%. Dùng dung môi kém phân cực để loại bỏ các hợp chất màu và các hợp chất kém phân cực khác. Phần dung dịch nước có chứa các chất flavonoid được trích ly với dung môi ethyl acetate để thu nhận các chất flavonoid. Cô đuổi dung môi, sấy khô thu được sản phẩm flavonoid tinh sạch.
b. Nghiên cứu lựa chọn các điều kiện công nghệ làm sạch
+ Lựa chọn dung môi làm sạch: Các dung môi được khảo sát cho quá trình loại chất màu và các chất kém phân cực gồm: n-hexane, petroleum ether, chloroform (CHCl3) và dichloromethane (CH2Cl2). Quá trình thí nghiệm được tiến hành như sau: 10g cao chiết các hợp chất flavonoid thô từ phế thải chè (có hàm lượng flavonoid 28,61%) được bổ sung thêm nước sao cho chất khô đạt 10%, rồi được trích ly bằng dung môi làm sạch với số lần trích ly là 3 lần, mỗi lần tỷ lệ dung môi/dịch cao chiết là 1/1. Sau đó, phần dung dịch nước chứa flavonoid được trích ly với dung môi ethyl acetate (trích ly một lần với tỷ lệ EtOAc/dung dịch flavonoid: 1,5/1) để thu nhận các chất flavonoid. Cô đuổi dung môi, sấy khô thu được sản phẩm flavonoid tinh sạch. Kết quả được trình bày ở bảng 3.39.
Bảng 3.39. Kết quả lựa chọn dung môi làm sạch
Dung môi Hiệu suất thu nhận sản phẩm, % Độ tinh khiết sản phẩm, % n-Hexane - 60,43 Petroleum ether - 62,28 Chloroform 51,26 84,76 Dichloromethane 51,34 84,51
Kết quả ở bảng 3.39 cho thấy trích ly bằng chloroform và dichloromethane đều cho sản phẩm có độ tinh khiết đạt > 84%, đạt yêu cầu đặt rạ Tuy nhiên, xét về tính độc hại, chúng tôi lựa chọn dichloromethane là dung môi thích hợp cho quá trình tinh chế sản phẩm flavonoid từ phế thải chè.
+ Lựa chọn tỷ lệ ethyl acetate/dung dịch flavonoid và số lần trích lỵ
Mục đích của nghiên cứu này là xác định được lượng ethyl acetate và số lần trích ly vừa đủ để tách triệt để flavonoid trong dung dịch nước sau khi loại bỏ chlorophyll. Kết quả khảo sát được trình bày trong bảng 3.40.
Bảng 3.40. Kết quả lựa chọn tỷ lệ EtOAc/dung dịch flavonoid và số lần trích ly
Số lần trích ly Tỷd lịệch flavonoid EtOAc/dung Hiệu suất thu nhận sản phẩm, % Độ tinh khiết sản phẩm, % 1 lần 1/1 48,79 84,54 1 lần 1,5/1 51,34 84,51 2 lần 2/1 (lần 1: 1/1; lần 2: 1/1) 52,68 84,45
Kết quả ở bảng 3.40 cho thấy tổng số lần trích ly cho hiệu quả cao nhất là 2 lần và tỷ lệ EtOAc/dung dịch flavonoid là 2/1. Độ tinh khiết của sản phẩm đạt 84,45% (kết quả HPLC ở phần phụ lục).
Sản phẩm các hợp chất catechins có độ tinh khiết 84,45% đạt tiêu chuẩn của đề tài, tuy nhiên có thể tăng độ tinh khiết bằng cách tách trên hệ phân tách cột đồng bộ Flash 150 Binary system điều kiện tách: cột ODS-C18 kích thước 250xØ2o mm, dung môi MeOH/H2O (20:80; v/v) vận tốc dòng chảy 10-20 ml/phút, UV=280 nm. Epigallocatechin gallate (EGCG) được phân lập qua hệ thống thiết bị này thường có độ tinh khiết ≥ 95%.
Từ các nghiên cứu phân tích và xử lý nguyên liệu, lựa chọn dung môi và phương pháp trích ly, lựa chọn các điều kiện công nghệ trích ly thích hợp, lựa chọn hệ dung môi làm sạch và phương pháp làm sạch, có thể rút ra quy trình công nghệ trích ly và làm sạch các chất flavonoid từ phế thải chè được thể hiện trên sơ đồ 3.3.
Phế thải chè (chè tươi, chè khô) Bã chè Xử lý nguyên liệu ấ Xay ( 2 < d 3 mm) Trích ly
- Dung môi EtOH 70% - Tốc độ khuấy: 300 v/ph - Số lần TL: 2 lần (1/7;1/5) - Tỷ lệ NL/DM: 1/12 - Thời gian: 1giờ/ lần - Nhiệt độ TL: 80oC Dịch trích ly EtOH 70% Phế thải chè (chè tươi, chè khô) Xử lý nguyên liệu Sấy khô to=70 - 80oC (W = 5%) Xay ( 1 < d ≤2 mm) EtOH 70%
Cô đặc trên thiết bị cô quay Buchi R-220
Áp suất chân không: 180 mbar; Nhiệt độ: 50oC
Sản phẩm Flavonoid tinh sạch
Thu hồi CH2Cl2
Phần tan trong H2O
Cô đuổi dung môi EtOAc
Trích ly lỏng-lỏng
Lớp EtOAc CH2Cl2, H2O
Tách loại tạp chất hữu cơ
Cao chiết Flavonoid Cao chiết Flavonoid
Phần tan trong CH2Cl2
Lớp H2O
Sấy khô
Sơđồ 3.3. Sơđồ quy trình công nghệ sản xuất flavonoid từ phế thải chè trên quy mô phòng thí nghiệm
Mô tả quy trình công nghệ sản xuất các chất flavonoid từ phế thải chè quy mô phòng thí nghiệm:
Phế thải chè được sấy khô ở nhiệt độ 70-80oC đến khi đạt độ ẩm 5%, xay đến độ mịn 1< d ≤ 2 mm. Trích ly bằng EtOH 70% với tỷ lệ nguyên liệu so với dung môi 1/12 (m/v), trích ly 2 lần (theo tỷ lệ lần 1: 1/7; lần 2: 1/5), nhiệt độ trích ly 80oC và tổng thời gian 2 lần trích ly là 2 giờ, tốc độ khuấy trộn là 200 vòng/phút, lọc bỏ bã cô đuổi dung môi thu được cao chiết flavonoid từ phế thải chè với hiệu suất trích ly 84,28% (hàm lượng flavonoid tổng trong cao chiết 48,61%). Cao chiết flavonoid được bổ sung thêm nước sao cho chất khô đạt 10%, rồi tiến hành trích ly bằng CH2Cl2 vào thùng phân ly với tỷ lệ 1/1 (v/v), trong 1 giờ. Sau đó, trích ly lần 2 lặp lại như lần 1. Dung dịch nước chứa flavonoid được trích ly lại bởi EtOAc với tỷ lệ EtOAc/dịch cao chiết là 1/1 (v/v). Khuấy kỹ rồi để phân ly hoàn toàn. Dung dịch EtOAc (lớp trên) được lấy ra, thực hiện trích ly tương tự cho lần 2. Gộp dung dịch EtOAc (chứa flavonoid lại) rồi cô kiệt dung môi bằng máy cô quay chân không đến trọng lượng không đổị Sấy đông khô ở nhiệt độ -55oC trong thời gian 24 giờ, áp suất 0,5-1 mm Hg sẽ nhận được sản phẩm flavonoit tinh sạch gồm các hợp chất catechins màu nâu nhạt, độ ẩm ≤6%, với độ tinh khiết 84,45%, hiệu suất thu nhận đạt 24,10% so với tổng lượng chất khô trong nguyên liệụ
3.4. Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ quy mô thực nghiệm và sản xuất thử nghiệm chiết tách các hợp chất flavonoid