Các chủng nấm men được nuơi cấy trong mơi trường YPD trước khi được nuơi cấy trong các mơi trường với nguồn C khác nhau, nguồn N khác nhau.
Bảng 2.2: Thành phần các mơi trường sử dụng (g/1L mơi trường) Cao nấm men Pepton cá
YNB Glucose Dầu thầu dầu Khoai tây Gạo Tween 80 YPD 10 20 - 20 - - - - YNBD - - 6,7 20 - - - - YPO 10 20 - - - 0,2 YNBO - - 6,7 - 5 - - 0,2 YP 10 20 - - - - YNB - - 6,7 - - - - - PD - - - 20 - 200 - - R - - - 20 - 2.1.3. Dầu BC
Cân chính xác 25 mg BC tinh thể và hịa tan vào trong 25 ml dầu ăn nĩng (80°C) (thêm dầu ăn nĩng nếu cần để hịa tan hồn tồn).
Định mức (với dầu ăn) sau khi để nguội về nhiệt độ phịng. 2.2. Phương pháp nghiên cứu
Nghiên cứu xây dựng quy trình nuơi cấy 2 chủng nấm men Y. lipolytica và S.
cerevisiae trên các điều kiện sinh trưởng khác nhau
2.2.1. Thí nghiệm khảo sát khả năng phát triển của nấm men trên các mơi trường thạch dinh dưỡng khác nhau tại các nhiệt độ khác nhau thạch dinh dưỡng khác nhau tại các nhiệt độ khác nhau
Mục đích
Khảo sát các nguồn C khác nhau: glucose, lipid (dầu ăn), tinh bột (khoai tây, gạo).
Khảo sát các nguồn N khác nhau: giàu dinh dường (cao nấm men + pepton), nghèo dinh dưỡng (YNB).
Mơi trường khơng cĩ nguồn C.
Các chủng nấm men khảo sát
Hai chủng truyền thống: TBS; TNS.c
Hai chủng khơng truyền thống: W29; VTCC 0544
Thành phần các mơi trường sử dụng (g trên 1L mơi trường)
Tế bào nấm men sau khi hoạt hĩa ở mơi trường YPDA trong 48h ở 27 °C được tiền tăng sinh trong mơi trường YPD sau đĩ cấy trang sang các mơi trường thạch dinh dưỡng khác nhau. Sau đĩ được nuơi cấy tại các nhiệt độ 20, 27, 30, 37 °C trong 48h để quan sát khả năng phát triển để làm tiền đề cho việc khảo sát khả năng phát triển của nấm men trên mơi trường lỏng. Thành phần mơi trường thạch dinh dưỡng với các nguồn cơ chất khác nhau được trình bày giống Bảng 2.2 nhưng cĩ bổ sung agar (20 g/ L).
Chỉ tiêu theo dõi : theo dõi khả năng phát triển mạnh yếu của các chủng. Nấm men trên các mơi trường với nguồn dinh dưỡng khác nhau tại các nhiệt độ khác nhau để làm tiền đề cho việc tiến hành nuơi cấy các chủng nấm men này trên mơi trường lỏng.
Sơ đồ thí nghiệm
Hình 2.1 Khảo sát khả năng phát triển của nấm men trên các mơi thạch dinh dưỡng
2.2.2. Khảo sát sự sinh trưởng của các chủng nấm men trong mơi trường tiền tăng sinh YPD sinh YPD
Mục đích : nhằm xây dựng đường cong sinh trưởng.
Tế bào nấm men sau khi hoạt hĩa ở mơi trường YPDA trong 48h ở 27 °C được cấy vào 100 ml mơi trường lỏng YPD ở OD600 0,25 trong bình tam giác 250 ml. Các
Chủng nấm men truyền thống và khơng truyền thống
Các mơi trường dinh dưỡng khác nhau
30 °C 27 °C
20 °C 37 °C
Chọn được mơi trường, nhiệt độ phát triển của các loại nấm men
bình này đem đi lắc ở thiết bị lắc ở 27°C và 150 rpm. Sau mỗi giờ tiến hành đo OD600 của mơi trường nuơi cấy.
Xác định được thời gian bắt đầu vào pha cân bằng.
2.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của các nguồn dinh dưỡng lên sự phát triển của nấm men men (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Các tế bào được nuơi trong mơi trường YPD ở 27 °C, 150 rpm và tới nấm men bắt đầu vào pha cần bằng. Sau đĩ, các tế bào được chuyển vào trong 200 ml mơi trường tăng sinh trong bình tam giác 500 ml, với nồng độ tế bào 6,5 x 106 tế bào mL-1 (tương ứng với OD = 0,25) và được giữ ở 27 °C, 150 rmp để khảo sát khả năng phát triển của nấm men trên các mơi trường khác nhau.
Mục đích: chọn nguồn dinh dưỡng thích hợp cho sự phát triển của nấm men và xây dựng đường cong sinh trưởng.
Thơng số cố định: Nhiệt độ: 27 °C.
pH: tự nhiên của mơi trường. Tốc độ lắc: 150 rpm.
Chỉ tiêu theo dõi: khối lượng sinh khối nấm men và xác định được thời gian bắt đầu vào pha cân bằng
Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Hình 2.2: Khảo sát ảnh hưởng của các nguồn dinh dưỡng lên sự phát triển của nấm men Chọn được mơi trường phát triển của
các loại nấm men Nuơi cấy ở 27°C, pH mơi
trường và lắc 150 rpm Chủng nấm men truyền thống và
khơng truyền thống
YPO YNBD
Khảo sát ảnh hưởng chủng giống nấm men, mơi trường nuơi cấy và điều kiện nuơi cấy (pH, tốc độ lắc và thể tích lắc) lên hiệu suất chuyển chất qua màng tế bào nấm men.
2.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của chủng giống nấm men đến hiệu suất chuyển chất BC BC
Tế bào nấm men Y. lipolytica và S. cerevisiae sau khi hoạt hĩa ở mơi trường
YPDA trong 48h ở 27 °C được tiền tăng sinh trong mơi trường YPD sau đĩ chuyển sang nuơi ở các mơi trường được chọn ở 2.2.3 và thời gian thu sinh khối căn cứ trên kết quả đường cong sinh trưởng ở mục 2.2.3.
Sinh khối thu được sau khi rửa 2 lần với nước cất tuyệt trùng và li tâm ở 8000 rpm trong 5 phút, cho tiếp xúc qua đêm với dầu BC. Sinh khối sau khi tiếp xúc đem đi rửa với đệm phosphate và được mang đi tách chiết ướt để xác định hiệu suất chuyển chất BC của hai chủng giống nấm men.
Hình 2.3: Khảo sát ảnh hưởng của chủng giống nấm men lên hiệu suất chuyển chất BC Tách chiết ướt
Li tâm, rửa 2 lần ở 8000 rpm, 5 phút, 4°C
Tiếp xúc qua đêm với dầu BC
Li tâm, rửa 2 lần ở 8000 rpm, 5 phút, 4°C Nuơi cấy ở 27°C, pH mơi trường và lắc 150 rpm
Chủng nấm men truyền thống và khơng truyền thống
Nuơi cấy trên mơi trường được chọn ở 2.2.3 và nhiệt độ ở 2.2.1, thể tích lắc 200ml, tốc độ lắc 150 rpm
2.2.5. Khảo sát ảnh hưởng của mơi trường nuơi cấy đến hiệu suất chuyển chất BC
Tế bào nấm men được chọn từ 2.2.4 sau khi hoạt hĩa ở mơi trường YPDA trong 48h ở 27 °C được tiền tăng sinh trong mơi trường YPD sau đĩ chuyển sang nuơi ở các mơi trường được chọn ở 2.2.3 và thời gian thu sinh khối căn cứ trên kết quả đường cong sinh trưởng ở mục 2.2.3.
Sinh khối thu được sau khi rửa 2 lần với nước cất tuyệt trùng và li tâm ở 8000 rpm trong 5 phút. Tế bào thu được đem đi phân tích sterol, đánh giá tính lỏng màng tế bào và cho tiếp xúc qua đêm với dầu BC. Sinh khối sau khi tiếp xúc đem đi rửa với đệm phosphate và được mang đi tách chiết ướt để xác định hiệu suất chuyển chất BC của nấm men trên các mơi trường khác nhau.
Hình 2.4: Khảo sát ảnh hưởng của mơi trường nuơi cấy lên hiệu suất chuyển chất BC Nuơi cấy ở 27°C, pH mơi trường
và lắc 150 rpm Nấm men được chọn từ mục
2.2.4
Nuơi cấy trên mơi trường được chọn ở 2.2.3 và nhiệt độ ở 2.2.1, thể tích lắc 200ml, tốc độ lắc 150 rpm
Li tâm, rửa 2 lần ở 8000 rpm, 5 phút, 4°C (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tiếp xúc qua đêm với dầu BC
Tách chiết ướt
Li tâm, rửa 2 lần ở 8000 rpm, 5 phút, 4°C
Phân tích sterol và đánh giá tính lỏng màng tế bào nấm men
2.2.5. Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nuơi cấy đến hiệu suất chuyển chất BC
Mục đích: chọn điều kiện thích hợp cho sự tiếp xúc BC
Các yếu tố đầu vào:
Mơi trường được chọn từ mục 2.2.5 Nhiệt độ được chọn từ mục 2.2.1
Chủng nấm men được chịn từ mục 2.2.4
Điều kiện nuơi cấy pH, thể tích lắc và tốc độ lắc được chọn và bố trí thí nghiệm theo mơ hình Box-Henhken được trình bày sau đây :
X1 pH [2 - 6]
X2 V [50 – 200]
X3 rpm [150 – 250]
Hàm mục tiêu
Y Hiệu suất chuyển chất qua màng
Bảng quy đổi biến mã và biến thực
Mức biến mã
Yếu tố đầu vào -1 0 1
X1 pH 2 4 6
X2 V 50 125 200
X3 Rpm 150 200 250
Thiết kế thí nghiệm theo mơ hình BOX-HENHKEN
No X1 X2 X3 Y pH V Rpm 1 -1 -1 0 2 125 150 2 1 -1 0 6 125 150 3 -1 1 0 2 125 250 4 1 1 0 6 125 250 5 -1 0 -1 2 50 200
6 1 0 -1 6 50 200 7 -1 0 1 2 200 200 8 1 0 1 6 200 200 9 0 -1 -1 4 50 150 10 0 1 -1 4 50 250 11 0 -1 1 4 200 150 12 0 1 1 4 200 250 13 0 0 0 4 125 200 14 0 0 0 4 125 200 15 0 0 0 4 125 200
Chỉ tiêu theo dõi: hàm lượng BC xâm nhập qua màng tế bào
2.2.6. Đánh giá sơ bộ khả nắng biến đối của hợp chất kị nước (BC) qua màng tế bào bào
Tế bào sau khi tiếp xúc qua đêm với dầu BC, rửa với đệm phosphate sau đĩ tiến hành tách chiết BC nhằm xác định hiệu suất chuyển chất đồng thời so sánh phổ quang học thu được khi đo trên máy đo Uvmini-1240 cat.no.206-24000-38, Nhật Bản với phổ quang học thu được từ BC chuẩn nhằm đánh giá khả năng biến đối của BC khi qua màng tế bào nấm men.
2.3. Phương pháp phân tích
2.3.1. Lựa chọn điều kiện nuơi cấy (mơi trường dinh dưỡng) và xây dựng đường cong sinh trưởng của nấm men trên các điều kiện lựa chọn. sinh trưởng của nấm men trên các điều kiện lựa chọn.
- Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đo độ đục tại bước sĩng 600 nm. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.3.2. Đánh giá tính chất màng tế bào thơng qua hàm lượng sterol và tính lỏng của màng tế bào màng tế bào
- Phân tích sterol.
Các sterol tồn tại trong tế bào dưới hai dạng: tự do trong màng tế bào chất và este hĩa (dạng dự trữ) là thành phần chính của các thể lipid.
Sử dụng n-heptan để tách chiết sterol và định lượng bằng phép đo quang phổ. Sterol tự do được tách chiết theo [56]. Sterol tổng số được tách theo [44]. Hàm lượng sterol được tính như phần trăm của khối lượng ẩm của tế bào:
% sterol (g/g) = [sterol] * f * v * 100/(m * 1000)
Trong đĩ: [sterol] là nồng độ của sterol, f là hệ số pha lỗng, v là thế tích heptan dùng để tách chiết, m là khối lượng sinh khối mang đi tách chiết.
- Đánh giá tính lỏng màng tế bào
Tính lỏng màng tế bào được đánh giá thơng qua tính dị hướng huỳnh quang của diphenylhexatriene (DPH) và dẫn xuất của DPH: 1-(4-trimethylammoniumphenyl)-6- phenyl-1,3,5-hexatriene (TMA-DPH) mà cĩ khả năng thay đổi nhĩm amino, được liên kết tại bề mặt tế bào khi tiếp xúc với nước. 1mM dung dịch stock được chuẩn bị trong dimethylformamide và bảo quản ở nhiệt độ phịng. Huyền phù tế bào được chuẩn bị trong đệm PBS (20mM, pH 5,6) tại A600 = 0,6-0,7. Sau khi thêm 2µl DPH 1mM hoặc TMA-DPH trong 3ml huyền phù tế bào, mẫu được đặt trong bể ổn nhiệt, tránh ánh sáng, tại 27 °C và được khuấy. Phép đo được thực hiện trên máy đo quang phổ huỳnh quang Jobin Yvon-Horiba model Fluorolog.3. Bước sĩng kích thích được thiết lập từ 360 nm và sự phát xạ đến 450 nm. Cường độ phát huỳnh quang đo được, được điều chỉnh cho nền huỳnh quang và ánh sáng tán xạ từ các mẫu khơng ghi nhãn. Tính dị hướng huỳnh quang (r) được tính theo cơng thức sau:
r = (IVV – GIVH)/ (IVV + GIVH), G = IHV / IHH
Trong đĩ IVV và IVH là các cường độ huỳnh quang được xác định tại hướng đứng và ngang của sự phát phân cực khi sự kích thích phân cực được thiết lập tại vị trí nằm ngang. Điều này áp dụng tương tự cho IHV và IHH khi sự kích thích phân cực thẳng đứng. G là yếu tố điều chỉnh cho nền huỳnh quang và ánh sáng tán xạ [5].
2.3.3. Tách chiết các chất kị nước và phân tích đánh giá sự biến đổi của chúng bằng phương pháp quang phổ hấp thụ UV – VIS bằng phương pháp quang phổ hấp thụ UV – VIS
Sinh khối nấm men thu được từ các mơi trường nuơi cấy cho tiếp xúc qua đêm với BC. Sau đĩ đem đi chiết và phân tích BC trong tế bào nấm men. Dung mơi tách chiết sử dụng là n-hexan [18].
Hàm lượng BC được xác định bằng phương pháp quang phổ tại bước sĩng 450nm theo cơng thức sau:
Trong đĩ:
A450: độ hấp thụ bước sĩng tại 450nm V (ml): thể tích tách chiết m (g): khối lượng sinh khối
Ngồi ra cĩ thế sử dụng phương pháp sắc ký để phân tích thành phần các chất cĩ được sau khi tách chiết.
2.3.4. Nhuộm lipid bằng thuốc nhuộm Nil red
Nil red (Sigma-Aldrich, St Quentin-Fallavier) là một hợp chất huỳnh quang trong mơi trường khơng phân cực; cấu trúc, phổ hấp thụ và bước song được thể hiện ở Hình 2.5
Hình 2.5 : Cơng thức cấu tạo và phổ hấp thụ và phát xạ của Nil red [45]
Nil red Bước sĩng (nm)
sự phát huỳnh quang Abs
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Khảo sát khả năng sinh trưởng của Y. lipolytica và S. cerevisiae
3.1.1. Đặc điểm hình thái của các chủng nấm men
3.1.1.1. Đặc điểm hình thái của Y. lipolytica trên mơi trường YPDA
Chúng tơi tiến hành nuơi cấy 2 chủng nấm men Y. lipolytica trên mơi trường
thạch YPDA ở nhiệt độ 27 °C và quan sát hình thái của chúng sau 3 ngày. Kết quả thu được như sau:
Bảng 3.1: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào của Y. lipolytica
Đặc điểm Hình thái khuẩn lạc Hình thái tế bào (vật kính 100X)
W29 0544 W29 0544 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình dạng Trịn Trịn
Màu sắc Màu đục Màu đục Cấu trúc Dạng khơ Dạng khơ
Bề mặt Lồi lõm Sần sùi Chủ yếu hình sợi dài, một số hình cầu hoặc hình trứng Chủ yếu hình cầu hoặc hình trứng Chủng W29
Hình 3.1: Hình thái khuẩn lạc của Y.
lipolytica W29 trên mơi trường YPDA
ở 27 °C
Hình 3.2: Hình thái tế bào Y. lipolytica
Chủng 0544:
Hình 3.3: Hình thái khuẩn lạc Y.
lipolytica 0544 trên mơi trường YPDA
ở 27 °C
Hình 3.4: Hình thái tế bào Y. lipolytica
0544 trên mơi trường YPDA ở 27 °C
Theo Barth G và cộng sự, hình thái khuẩn lạc của chủng Y. lipolytica phụ thuộc
vào thành phần mơi trường, điều kiện phát triển như nguồn C, N, pH, điều kiện thơng khí…Hình thái khuẩn lạc cĩ thể là trơn nhẵn; sáng bĩng đến xoắn, lồi lõm, sần sùi,
màu tối [12]. Tế bào của chủng Y. lipolytica cĩ dạng hình cầu, hình trứng hoặc thường xuyên kéo dài để tạo thành vách năng sợi nấm [41]. Vì vậy, sau khi quan sát khuẩn lạc và tế bào của Y. lipolytica W29 và 0544 trên mơi trường YPDA cho thấy khuẩn lạc cĩ
màu đục, sần sùi; tế bào hình cầu, hình trứng hoặc hình sợi kéo dài cĩ vách ngăn và cĩ sự tương đồng với các nghiên cứu trước đây về đặc điểm hình thái nấm men và khả năng đây là chủng giống nấm men cần sử dụng.
3.1.1.2. Đặc điểm hình thái S. cerevisiae trên mơi trường YPDA
Trên mơi trường YPDA, sau 3 ngày nuơi cấy ở 27 °C, chủng nấm men S.
cerevisiae cĩ đặc điểm như sau:
Bảng 3.2: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào của S. cerevisiae
Đặc điểm Hình thái khuẩn lạc Hình thái tế bào (vật kính 100X)
TNS.c TBS TNS.c TBS
Hình dạng Trịn Trịn
Màu sắc Màu trắng sữa đồng đều, thuần nhất Màu trắng sữa Cấu trúc Đồng nhất, dạng bột nhão Dạng bột nhão Bề mặt Nhẵn bĩng Nhẵn bĩng Chủ yếu hình trịn hoặc bầu dục, cĩ khơng bào Chủ yếu hình trịn hoặc bầu dục, cĩ khơng bào
Chủng TNS.c
Hình 3.5: Hình thái khuẩn lạc của S.
cerevisiae TNS.c trên mơi trường YPDA
ở 27 °C
Hình 3.6: Hình thái tế bào của (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
S. cerevisiae TNS.c trên mơi trường
YPDA ở 27 °C
Chủng TBS
Hình 3.7: Hình thái khuẩn lạc của S.
cerevisiae TBS trên mơi trường YPDA
ở 27 °C
Hình 3.8: Hình thái tế bào của
S. cerevisiae TBS trên mơi trường
YPDA ở 27 °C
Theo các nghiên cứu trước đây, hình thái khuẩn lạc và tế bào của S. cerevisiae
thay đổi tùy thuộc vào điều kiện nuơi cấy, thay đổi từ khuẩn lạc cĩ bề mặt nhẵn bĩng đến xù xì. Trong số một ngàn chủng phát triển trên mơi trường YPD chỉ cĩ 2,5% tồn tại ở dạng khuẩn lạc gồ ghề, xù xì [19]. Tế bào cĩ dạng hình ovan, đơi khi hình trịn. Kích thước trung bình 4-6 µm. Khơng bào thay đổi rõ rệt trong quá trình nuơi cấy.