Màng sinh chất đĩng vai trị quyết định trong sự trao đổi chất giữa tế bào và ngoại bào. Nĩ cho nhiều chất đi qua theo cả hai hướng. Các chất đi vào tế bào là những chất cần thiết cho các quá trình sống và là nguyên liệu để tổng hợp nên các chất xây dựng tế bào, cịn các chất thải ra là các sản phẩm trao đổi chất, chất dư thừa. Sự vận chuyển chất qua màng khơng chỉ phụ thuộc vào kích thước và bản chất chất được vận chuyển mà cịn phụ thuộc vào cấu tạo và tính chất của màng. Sự vận chuyển cĩ thể là thụ động khơng tiêu phí năng lượng hoặc theo phương thức hoạt tải – vận chuyển tích cực kèm theo tiêu phí năng lượng ATP. Sự chuyển vận cịn tùy thược vào sự cĩ mặt của các protein màng, hoặc do sự thay đổi hình dạng của màng.
Vận chuyển thụ động
Vận chuyển thụ động là phương thức vận chuyển các chất qua màng sinh chất mà khơng tiêu tốn năng lượng.
Chất tan được vận chuyển thụ động qua màng bằng cơ chế khuếch tán: di chuyển từ nơi cĩ nồng độ cao đến nơi cĩ nồng độ thấp.
Sự khuếch tán hồn tồn phụ thuộc vào sự chênh lệch nồng độ các chất tan giữa mơi trường bên trong và bên ngồi tế bào.
Sự khuếch tán của các phân tử nước qua màng gọi là sự thẩm thấu Cĩ 2 con đường khuếch tán qua màng sinh chất:
+ Sự khuếch tán qua lớp photpholipit kép: gồm các phân tử cĩ kích thước nhỏ, khơng phân cực (O2, CO2...) hay các phân tử tan trong lipit.
Hình 1.2: Khuếch tán qua lớp kép photpholipid [70] + Sự khuếch tán qua kênh protein mang tính chọn lọc.
Hình 1.3: Khuếch tán qua kênh protein [69]
Vận chuyển chủ động:
Vận chuyển chủ động là sự vận chuyển các chất qua màng mà cần: + Tiêu tốn năng lượng
+ Ngược chiều nồng độ.
Vận chuyển chủ động cần các kênh protein màng. Mỗi loại protein cĩ thể vận chuyển một chất riêng hoặc hai chất, cùng chiều hoặc ngược chiều.
Vận chuyển chủ động phụ thuộc vào nhu cầu của tế bào và cơ thể.
Hình 1.4: Sự vận chuyển các chất qua màng tế bào theo cơ chế chủ động [71] Nhờ sự vận chuyển chủ động mà tế bào:
+ Hấp thu các chất cần thiết cho tế bào dự trữ: đường, axit amin, Na+, K+... + Loại bỏ các chất thải.
Xuất bào và nhập bào: là hai kiểu vận chuyển các chất qua màng bằng cách biến dạng màng và tiêu tốn năng lượng.
Xuất bào là hình thức đưa các chất ra ngồi tế bào, là hiện tượng tạo thành các bĩng xuất bào trong tế bào chất từ mạng lưới nội sinh chất và phức hệ Golgi. Bĩng xuất bào được bao bởi màng và chứa các chất tiết như các chất mucigen, zymogen, các hormon…hoặc các chất thừa mà tế bào khơng dùng đến cần bài xuất ra khỏi tế bào.
+ Bĩng bào sẽ được di chuyển đến màng sinh chất và gắn vào mặt trong màng sinh chất.
+ Màng bị đứt ở vị trí tiếp xúc và do đĩ bĩng xuất bào được mở ra và các chất chứa được giải phĩng ra ngồi tế bào.
Nhập bào là hình thức tế bào thu nhận các chất cĩ kích thước phân tử lớn, là sự hình thành các bĩng nội bào do sự lõm vào và tách ra của một phần màng cĩ chứa một chất rắn hoặc dịch lỏng.
Cĩ 2 bước:
+ Sự tạo thành bĩng màng (khơng bào) chứa các đại phân tử
+ Bĩng màng tách khỏi màng nguyên sinh, đưa các chất vào trong tế bào - Chất được thu nhận là chất rắn gọi là thực bào, chất lỏng gọi là ẩm bào 1.2. Beta Caroten và cơng nghệ bao gĩi BC bằng tế bào nấm men
1.2.1. Beta Caroten
Beta caroten là một loại carotenoid phổ biến nhất được tìm thấy trong thực phẩm và là tiền thân chủ yếu của vitamin A (cơ thể cĩ thể chuyển BC thành vitamin
A). BC cĩ màu cam, thường thấy trong các loại trái cây và rau quả cĩ màu cam như cà rốt, bí ngơ, đào, khoai lang đỏ,…nhiều nghiên cứu đã chứng tỏ vai trị và ích lợi của BC trên hệ miễn dịch, ngăn ngừa nhiều loại ung thư và giảm tác hại của ánh nắng mặt trời.
Cấu tạo:
BC cĩ cơng thức hĩa học gần giống như lycopene nhưng khác nhau về cấu trúc. Phân tử cĩ 9 liên kết đơi và kết thúc bộ khung cacbon là 2 vịng β-ionone. Cấu trúc đặc biệt xác định các thuộc tính đặc biệt của BC.
Hình 1.5: Cơng thức cấu tạo của BC [67]
Tính chất:
BC ở dạng tinh thể cĩ màu đỏ đậm; bền trong mơi trường kiềm và khơng bền trong mơi trường acid, tan tốt trong dầu, ete, hexan và các dung mơi hữu cơ như aceton, methanol…khơng tan trong nước và bị hấp thụ bởi ánh sáng. Sự hấp thụ lớn nhất của BC ở các dung mơi khác nhau được giới thiệu ở Bảng 1.5 và phổ hấp thụ quang học BC ở Hình 1.6.
Bảng 1.5: Một số phổ UV-Vis của BC khi chiết trong các dung mơi khác nhau [22]
Carotenoid Dung mơi λmax, nm
BC Acetone
Chloroform Ethanol
Hexane, petroleum ether
(429) (435) (425) (425) 452 461 450 450 478 485 478 477
Hình 1.6: Phổ UV-VIS của BC [22]
Nhờ cĩ hệ thống nối đơi liên hợp dài mà BC cĩ ái lực mạnh với oxy đơn bội nên dễ bị oxy hĩa, đồng phân hĩa khi tiếp xúc với khơng khí, ánh sáng hay nhiệt độ.
BC nhạy cảm với oxy, sự đồng phân hĩa xảy ra dưới sự ảnh hưởng bởi ánh sáng, nhiệt độ, và oxy. Vì vậy phải giữ ở điều kiện tránh ánh sáng, bảo quản trong bao bì kín với nitro hoặc argon trong thời gian sử dụng dài.
Hoạt tính sinh học:
BC chứa 2 vịng β-ionone, đĩ chính là hoạt tính của tiền vitamin A. Khi ở dạng tiền vitamin A, nĩ bảo vệ nhiễm sắc tố da chống lại hiệu ứng cĩ hại của các tia tử ngoại. Người ta khuyên nên dùng bổ sung BC trước khi làm việc lâu dài dưới ánh nắng mặt trời. Nĩ cĩ thể giúp da phịng chống bệnh ung thư da trong một thời gian dài.
Dựa trên các nghiên cứu, người ta đã kết luận rằng BC cùng với vitamin C, E, đồng, mangan thì vitamin A, BC cĩ vai trị quyết định đến sự ngăn ngừa, chống lại các gốc tự do (là các chất tự do kém bền và hoạt động mạnh, nĩ cĩ khả năng kết hợp với các phân tử khác, đặc biệt là lipid và gây nên một phản ứng dây chuyền cực kỳ nguy hiểm đối với tế bào và là nguồn gốc của các căn bệnh như tim mạch, quá trình lão hĩa,
giảm trí nhớ, ung thư…). Cơ chế chống oxy hĩa: [20,40,37,58]
Trong cơ thể, carotenoids nĩi chung và BC nĩi riêng cĩ khả năng triệt tiêu các gốc tự do, dập tắt các chuỗi phản ứng dây chuyền. Nhờ cĩ hệ thống liên hợp, nĩ vơ hiệu hĩa phân tử oxi bị kích hoạt (1O2). Một phân tử BC cĩ hấp thụ năng lượng của oxy nguyên tử rồi giải phĩng năng lượng ấy dưới dạng nhiệt vơ hại.
BC khơng độc đối với cơ thể khi sử dụng ở liều lượng cao và kéo dài, trong khi nếu ta sử dụng vitamin A kéo dài và với liều cao thì sẽ gây rối loạn thị giác, rối loạn chức năng gan. Nguyên nhân chính là do cơ thể chuyển hĩa BC thành vitamin A khi cĩ nhu cầu. Chỉ 1/6 lượng BC chuyển thành vitamin A [30].
BC là một nguồn provitamin A phong phú trong thức ăn để giúp phịng ngừa thiếu vitamin A. Vitamin A đĩng vai trị quan trọng trong nhiều bộ phận của cơ thể, như hệ thống miễn dịch, thị giác, cơ quan sinh sản, … BC đã được cơng nhận là hợp chất chống ung thư [61].
1.2.2. Cơng nghệ bao gĩi beta caroten
Carotenoid nĩi chung hay BC nĩi riêng là những chất rất nhạy cảm và dễ dàng bị phá hủy khi tiếp xúc với oxy, ánh sáng trong quá trình bảo quản hoặc sản xuất thực phẩm. Điều này cĩ thể gây ra những mất mát về mặt dinh dưỡng, các hoạt tính sinh học cũng như sản xuất các chất thơm, mùi vị khơng mong muốn. Vì những lí do đĩ, các hoạt chất này thường khơng được sử dụng dưới dạng tinh thể mà thơng qua dạng bao gĩi của chúng.
B. Ozcelik và cộng sự [48] đã nghiên cứu tạo vi nang bằng các kỹ thuật bao gĩi khác nhau như: sấy phun, đơng khơ, bẫy alginat để tạo lớp vỏ bao bọc bảo vệ các BC bên trong. Khi tạo vi nang BC bằng kỹ thuật sấy phun sử dụng chất nhũ hĩa là Tween 80 với vật liệu bao gĩi là maltodextrin đạt hiệu suất bao gĩi tốt nhất (81%), sản phẩm vi nang BC tạo thành cũng cĩ khả năng hịa tan trong nước cao nhất đạt 87%. Trong khi đĩ, Trần Hải Đăng và cộng sự [3] đã nghiên cứu cơng nghệ vi nang để bao gĩi dầu gấc đạt tiêu chuẩn thực phẩm từ các hệ nhũ tương theo các phương pháp vi nang hĩa khác nhau: đơng tụ và sấy phun. Đối với phương pháp sấy phun, vi nang tạo thành cĩ màu vàng cam và tồn tại dưới dạng bột mịn với 86.2% hạt cĩ kích thước < 10 µm. Hiệu suất tạo vi nang cao nhất đạt 70.4%. Đối với phương pháp đơng tụ, vi nang tạo thành cĩ dạng hạt trịn, màu cam đến đỏ. Hiệu suất tạo vi nang đạt tới 96% với kích thước vi nang < 40μm…
Nhìn chung, các phương pháp bao gĩi thơng thường này gặp phải một số hạn chế như:
- Cấu tạo vỏ bao khơng liên tục. Vỏ cĩ thể bị đứt gãy do quá trình sấy (mất nước cục bộ) làm cho khả năng bảo vệ của vỏ suy giảm.
- Hạn chế trong việc chọn vật liệu bao gĩi như dung dịch trong dung mơi, tương tác với lõi, tính ổn định….
- Quá trình chế biến phức tạp, đơi khi khơng đạt chuẩn thực phẩm như chọn hệ dung mơi để rửa…
Vì vậy, trong những năm gần đây, việc sử dụng tế bào nấm men để bao gĩi các hoạt chất cĩ hoạt tính sinh học như chất thơm, BC… ngày càng được quan tâm.
Gần đây tế bào nấm men được khai thác bởi một số người bởi tiềm năng của chúng như kiểm sốt sự phân phối đối với sự giải phĩng chất thơm và để cải thiện khả năng sinh học của các thuốc kém hịa tan. Thực vậy, theo Shark thì tế bào nấm men được nghiên cứu từ những năm 1970 khi phịng thí nghiệm Serozyme, Pháp và Swift và Co., Mỹ đã sáng chế ra một kỹ thuật sử dụng tế bào nấm men chứa hơn 40% lipid. Họ đã mơ tả việc bao gĩi thuốc nhuộm, thuốc và chất thơm khi sử dụng vi sinh vật sống và chết bao gồm nấm và động vật nguyên sinh. Cơ chế của quá trình bao gĩi trong nấm men liên quan đến ái lực tương đối của nguyên liệu được bao gĩi với pha lipid trong của tế bào nấm men. Các thành phần chất thơm mà tương tác với dung dịch lí tưởng với pha lipid sẽ được bao gĩi với mức độ tốt nhất.
Vấn đề được đề cập ở đây là pha lipid trong màng là lớp phospholipid màng khơng giống như câú trúc mixen điển hình. Hoạt động khơng phân cực (như BC) cĩ thể mong đợi sự tồn tại phía trong mixen, tuy nhiên kích thước phân tử của chúng sẽ liên quan đến các thay đổi hình học của mixen và do đĩ các hydrocacbon phân tử lượng cao cĩ thể bị loại trừ khỏi tế bào.
Cân bằng lại chất thơm, sử dụng bao gĩi để biến đổi các tính chất của pha lỏng trong để bù đắp lượng khơng cân đối, và những thay đổi tế bào khác như sự chiết của thành tế bào khi sử dụng chất tẩy để cải thiện tính thấm đã giúp đỡ việc mở rộng vùng phân phối của tế bào nấm men như tạo thành các nang.
Thực vậy, thành phần và chiều dày của thành tế bào nấm men cĩ thể bị thay đổi khi sử dụng các chủng tế bào khác nhau do sự biểu hiện của enzyme hoặc bởi sự thay đổi gen liên quan đến quá trình sinh tổng hợp hoặc phân hủy trong thành tế bào .
Dưới điều kiện sấy (ví dụ như hoạt độ nước dưới 0,7), tốc độ bay hơi được xem như thấp do đĩ giới hạn quá trình chuyển khối. Sự giải phĩng chất thơm cĩ thể được phục hồi nhờ sự tái hydrat hĩa. Normand và cộng sự [46] đã sử dụng limonene như vật mơ hình đối với chất thơm kị nước và chất thơm cần quan tâm – cơ chế giải phĩng với
sự quan sát đến cấu trúc thành tế bào nấm men và sự thẩm thấu ngược trong suốt quá trình sấy các tế bào nấm men. Nền tảng của lực phân phối đối với việc giải phĩng chất thơm từ các tế bào nấm men bị hydrat hĩa hiện diện trong sự thỏa thuận tốt với lý thuyết mơ tả sự giải phĩng dung dịch thơ, một lý thuyết được mơ tả bởi Crank [35].
Sử dụng tế bào nấm men làm vật liệu bao gĩi sẽ khắc phục các nhược điểm của các phương pháp bao gĩi thơng thường như :
- Các dung mơi sử dụng để rửa tế bào nấm men trong quá trình bao gĩi được yêu cầu nghiêm ngặt do đĩ làm tăng tính an tồn thực phẩm.
- Vi nang tạo ra đồng nhất về mặt cấu trúc và kích thước nên chịu được nhiệt
độ, pH… do cấu trúc vỏ liên tục, khơng bị đứt gãy.
- Một số trường hợp cải thiện tính chất cảm quan của sản phẩm.
- Phân tán tốt hơn trong mơi trường thực phẩm do kích thước nấm men nhỏ 3 –
10µm, bề mặt cĩ tính chất ưa và kị nước.
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
2.1.1. Nguồn nấm men
Các nguồn được nấm men được sử dụng trong nghiên cứu này được giới thiệu ở Bảng 2.1:
Bảng 2.1: Các nguồn nấm men được sử dụng trong nghiên cứu
Chủng Nguồn nấm men Xuất xứ
Yarrowia lipolytica
W29 Được cung cấp bởi trường AgroSup Dijon, Pháp
Khơng truyền thống
VTCC 0544 Được cung cấp bởi Viện Cơng nghiệp Thực phẩm, Hà Nội.
Saccharomyces cerevisiae
TBS Được cung cấp bởi Viện Cơng nghiệp Thực phẩm, Hà Nội.
Truyền thống
TNS.c Được cung cấp bởi trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên thành phố Hồ Chí Minh.
Các nguồn này được bảo quản ở -20 °C. Sau khi rã đơng ở nhiệt độ phịng, các nguồn này được hoạt hĩa trên mơi trường YPDA (cao nấm men 10 g/l; pepton cá (20 g/l; glucose 20 g/l; agar 20 g/l) trong đĩa petri trong 48h ở 27 °C. Sau đĩ, các đĩa này được bảo quản ở 4 °C và được sử dụng cho việc nuơi cấy sau này.
2.1.2. Mơi trường nuơi cấy
Các chủng nấm men được nuơi cấy trong mơi trường YPD trước khi được nuơi cấy trong các mơi trường với nguồn C khác nhau, nguồn N khác nhau.
Bảng 2.2: Thành phần các mơi trường sử dụng (g/1L mơi trường) Cao nấm men Pepton cá
YNB Glucose Dầu thầu dầu Khoai tây Gạo Tween 80 YPD 10 20 - 20 - - - - YNBD - - 6,7 20 - - - - YPO 10 20 - - - 0,2 YNBO - - 6,7 - 5 - - 0,2 YP 10 20 - - - - YNB - - 6,7 - - - - - PD - - - 20 - 200 - - R - - - 20 - 2.1.3. Dầu BC
Cân chính xác 25 mg BC tinh thể và hịa tan vào trong 25 ml dầu ăn nĩng (80°C) (thêm dầu ăn nĩng nếu cần để hịa tan hồn tồn).
Định mức (với dầu ăn) sau khi để nguội về nhiệt độ phịng. 2.2. Phương pháp nghiên cứu
Nghiên cứu xây dựng quy trình nuơi cấy 2 chủng nấm men Y. lipolytica và S.
cerevisiae trên các điều kiện sinh trưởng khác nhau
2.2.1. Thí nghiệm khảo sát khả năng phát triển của nấm men trên các mơi trường thạch dinh dưỡng khác nhau tại các nhiệt độ khác nhau thạch dinh dưỡng khác nhau tại các nhiệt độ khác nhau
Mục đích
Khảo sát các nguồn C khác nhau: glucose, lipid (dầu ăn), tinh bột (khoai tây, gạo).
Khảo sát các nguồn N khác nhau: giàu dinh dường (cao nấm men + pepton), nghèo dinh dưỡng (YNB).
Mơi trường khơng cĩ nguồn C.
Các chủng nấm men khảo sát
Hai chủng truyền thống: TBS; TNS.c
Hai chủng khơng truyền thống: W29; VTCC 0544