Đối với vắcxin virút sống giảm độc lực, việc giải mã bộ gen của virút mang ý nghĩa rất quan trọng nhằm đánh giá sự thay đổi của virút trước tiên về mặt di truyền qua các đời nuôi cấy và tiếp theo là kiểu hình của virút. Do các đột biến xuất hiện
72
trong kiểu gen có thể dẫn đến tăng độc tính của virút, nên các đột biến có xuất hiện cần được xem xét kĩ lưỡng.
Các chủng gốc giống virút dengue sau khi nuôi cấy được giải mã trình tự toàn bộ bộ gen, so sánh với bộ gen của các chủng virút dengue đời trước đó tương ứng (ở đây là các chủng nhận từ NIH) để phân tích sự thay đổi sau quá trình nuôi cấy, thu hoạch.
Các bước chính giải mã trình tự toàn bộ bộ gen của từng chủng dengue được trình bày tại phần phương pháp bao gồm:
- Tách chiết ARN virút dengue
- Tổng hợp cDNA virút bằng hexamer primer ngẫu nhiên.
- Tổng hợp các đoạn DNA sợi kép một phần chùm lên nhau bao phủ toàn bộ bộ gen của virút (2000 – 2500 base mỗi sản phẩm) bằng PCR.
- Làm sạch các sản phẩm PCR và giải trình tự.
Kết quả giải trình tự và phân tích so sánh các chủng gốc giống dengue (xem phụ lục) được tóm tắt theo bảng dưới đây:
Bảng 6. Tóm tắt kết quả giải mã trình tự gen các chủng gốc giống
Tên chủng Nucleotide thay đổi trên gen
so với chủng gốc giống
Thay đổi về kiểu hình
rDEN1∆30 Không có sự thay đổi Không có sự thay đổi rDEN2/4∆30(ME) Vị trí 1835 hộn của 2 loại
base T và C
Không thay đổi do cả 2 loại base đều trong codon mã hóa cho Tyr
rDEN3∆30/31 Không có sự thay đổi Không có sự thay đổi rDEN3-3’D4∆30 Không có sự thay đổi Không có sự thay đổi
73
rDEN4∆30 Không có sự thay đổi Không có sự thay đổi rDEN4∆30-200,201 Vị trí 7141 hộn của 2 loại
base C (giống chủng NIH) và T
C tạo thành codon mã hóa cho Thr còn T tạo thành codon mã hóa cho Ile.
Kết quả giải trình tự 06 chủng và phân tích cho thấy:
- Các chủng rDEN1∆30, rDEN3∆30/31, rDEN3-3’D4∆30, rDEN4∆30 không có sự thay đổi ở bất kỳ vị trí nucleotide nào. Bộ gen của các chủng gốc giống này được bảo toàn và không bị thay đổi so với chủng nhận được từ NIH. - Chủng rDEN2/4∆30(ME) có sự hiện diện cùa 2 loại nucleotide ở vị trí 1835.
Tuy nhiên đây là đột biến câm do chúng không làm thay đổi axit amin mà chúng mã hóa. Do đó bộ gen của chủng rDEN2/4∆30(ME) có 1 sự thay đổi so với chủng nhận được từ NIH nhưng không tạo ra thay đổi về kiều hình. - Chỉ duy nhất chủng rDEN4∆30-200,201 có 1 vị trí thay đổi có thể gây ra sự
thay đổi sau dịch mã so với chủng tương ứng nhận được từ NIH. Tuy nhiên, vị trí đột biến ở vùng NS4B này đã quan sát được khi nghiên cứu sự thích ứng của một số chủng rDEN4 trên tế bào Vero trước đây tại NIH và được chứng minh không gây ảnh hưởng tới độc tính của virút và kháng nguyên bảo vệ.