Nguyên tắc
Do virút dengue có tính hủy hoại yếu nên phương pháp nhuộm plaque thông thường như crystal violet không phát hiện được mà phải sử dụng bằng phương pháp nhuộm miễn dịch. Đầu tiên kháng thể được đưa vào các giếng và gắn vào virút, tiếp theo kháng thể 2 cộng hợp peroxidase được đưa vào để gắn với kháng thể 1. Cuối cùng cơ chất được đưa vào để hiện màu (Hình 12)
Các bước tiến hành
a. Cố định tế bào
- Hút bỏ toàn bộ môi trường trong mỗi giếng trên phiến sau 5 - 6 ngày nuôi ủ. Tráng rửa mỗi giếng 1 ml PBS + 10 % formandehit, 2 lần.
- Thêm 0.5 ml methanol 80 % vào mỗi giếng, ủ nhiệt độ phòng trong 10 phút. b. Nhuộm phiến
- Bỏ toàn bộ methanol dư thừa.
- Thêm 1 ml dung dịch PBS + 5% skim milk vào mỗi giếng. Ủ tại nhiệt độ phòng 10 phút.
- Đổ bỏ dung dịch trong phiến vào cốc đựng.
- Pha loãng kháng thể kháng virút dengue trong dung dịch pha loãng (PBS+5% skim milk)
54
- Thêm vào mỗi giếng 200 µl dung dịch đã pha loãng kháng thể kháng týp huyết thanh dengue tương ứng. Ủ phiến trong máy lắc ở nhiệt độ 37oC, lắc 60 vòng/ phút, trong 60 phút.
- Đổ bỏ dung dịch kháng thể vào cốc đựng.
- Rửa mỗi giếng 2 lần bằng 1 ml dung dịch PBS + 5 % Skim milk.
- Thêm vào mỗi giếng 200 µl dung dịch kháng thể IgG dê kháng chuột cộng hợp peroxidase (pha loãng 1:2000 trong dung dịch PBS + 5 % Skim milk). Ủ phiến trong máy lắc ở nhiệt độ 37oC, 60 vòng/ phút, trong 60 phút.
- Đổ bỏ dung dịch kháng thể vào cốc đựng.
- Rửa mỗi giếng 2 lần bằng 1 ml dung dịch PBS, loạt bỏ hết dung dịch rửa. - Đặt phiến tại nơi thoáng gió, để phiến khô tự nhiên trong khoảng 5 phút.
- Thêm vào mỗi giếng 160 µl dung dịch TrueBlue substrate. Lắc nhẹ phiến và giữ tại nhiệt độ phòng tới khi các plaque hiện màu (khoảng 5 – 15 phút). Đếm số lượng plaques trong các giếng. Ghi số lượng plague vào phiếu đọc kết quả.