Trong quá trình nuôi cấy virút, nhiệt độ và môi trường nuôi cấy đóng vai trò hết sức quan trọng. Nhiệt độ quá cao có thể ức chế bất hoạt virút dengue trong khi nhiệt độ quá thấp làm giảm hiệu suất nhân lên của virút. Môi trường nuôi cấy virút dengue khác nhau cũng làm cho hiệu giá virút khác nhau, do đó môi trường nuôi cấy có thể được điều chỉnh nhằm tăng hiệu giá virút dengue.
Các chai tế bào Vero sau 2-3 ngày nuôi cấy, tế bào phủ kín 90-95% sẽ được gây nhiễm các chủng virút dengue với liều gây nhiễm MOI=0.01. Sau khi gây nhiễm virút các chai được bổ sung môi trường LH3E và khảo sát nuôi tại các nhiệt độ 35oC hoặc 37oC trong 6 ngày hoặc 7 ngày (đối với 2 chủng rDEN3). Virút dengue sau khi thu hoạch sẽ được chuẩn độ hiệu giá và nhuộm plaque bằng phương pháp miễn dịch.
64
Bảng 3. Hiệu giá virút dengue nuôi cấy tại các nhiệt độ khác nhau
Kết quả khảo sát cho thấy chênh lệch hiệu giá khi nuôi các chủng virút dengue ở 2 điều kiện nhiệt độ này không nhiều, từ 100.2 đến 100.3 PFU/ml. Các chủng rDEN1∆30, rDEN4∆30, rDEN3∆30/31, rDEN3-3’D4∆30 nuôi cấy tại nhiệt độ 37oC cho hiệu giá cao hơn so với nuôi cấy tại 35oC. Trong khi đó các chủng rDEN2/4∆30(ME), và rDEN4∆30-200,201 cho hiệu giá cao hơn khi nuôi tại 35oC. Nhiệt độ cho hiệu giá cao hơn sẽ được lựa chọn làm điều kiện nuôi cấy chủng virút dengue tương ứng.
Trong các thí nghiệm trên, hiệu giá của cả 2 chủng rDEN3 đều chưa đạt được 106 PFU/ml nên cần được khảo sát thêm với môi trường nuôi cấy khác nhằm tăng hiệu giá virút. Môi trường được thử nghiệm để so sánh với LH3E đó là MEM optiPRO SFM, đây cũng là môi trường không huyết thanh của GIBCO đảm bảo các tiêu chuẩn trong nuôi cấy tế bào.
Hai chủng rDEN3 sau khi được gây nhiễm ở cùng một điều kiện MOI= 0.01 sẽ được bổ sung 2 loại môi trường khác nhau, LH3E và MEM OptiPro SFM tại 37oC
rDEN1∆30 rDEN2/4∆30( ME) rDEN3∆30/31 rDEN3- 3’D4∆30 rDEN4∆30 rDEN4∆30- 200,201 T = 35oC 7.2 7.4 5.3 5.5 7.2 6.9 T = 37oC 7.4 7.2 5.6 5.7 7.4 6.6 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 H Iệu gi á lg PF U/m l
65
trong 7 ngày. Kết quả chuẩn độ các chủng rDEN3 sau khi thu hoạch cho thấy môi trường MEM OptiPro SFM cho hiệu giá cả 2 chủng virút rDEN3 cao hơn khoảng 10 lần so với nuôi trên môi trường LH3E ở cùng điều kiện. Hiệu giá này cũng đã đạt tiêu chuẩn cao hơn 106 pfu/ml.
Bảng 4. Hiệu giá virút rDEN3 nuôi trong các môi trường khác nhau
Môi trường OptiPRO SFM cho hiệu suất nuôi cấy virút cao hơn LH3E nên được lựa chọn để nuôi 2 chủng rDEN3 này.