Nguyên tắc
Để đảm bảo cho virút nhân lên hiệu quả trong tế bào, quá trình gây nhiễm sẽ được tiến hành khi tế bào đang ở pha sinh trưởng, phủ kín 90% đến 95% bề mặt chai. Khảo sát liều gây nhiễm và môi trường phù hợp để đạt hiệu giá virút sau nuôi cấy tốt nhất.
Các bước tiến hành
- Làm ấm môi trường không huyết thanh, PBS ở 37oC.
- Kiểm tra mức độ phủ kín của tế bào Vero trên bề mặt chai (từ 85% đến 95%).
51
- Tách 2-3 chai tế bào để đếm và tính số lượng tế bào trong mỗi chai (xem phương pháp cấy chuyển tế bào). Từ đó tính lượng virút dengue cần để gây nhiễm theo công thức dưới đây:
Trong đó: X là thể tích hỗn dịch virút cần gây nhiễm cho một chai tế bào (ml).
A là tổng số tế bào trong một chai tế bào (ml).
B là hiệu giá của chủng sản xuất trong 1ml (PFU/ml)
MOI là liều gây nhiễm tính theo số virút gây nhiễm cho 100 tế bào
- Pha loãng X (ml) virút dengue tính ở trên trong 10 ml môi trường không huyết thanh (cho mỗi chai T150). Ví dụ: với liều gây nhiễm MOI = 0.01, 2x107 tế bào/chai T150, hiệu giá virút 106 PFU/ml thì thể tích virút (X) cần cho mỗi chai sẽ là 0,2 ml.
- Tráng rửa mỗi chai tế bào T150 bằng 15 ml môi trường không huyết thanh. - Bổ sung 10 ml hỗn dịch virút sau pha loãng vào mỗi chai.
- Láng đều bề mặt, ủ các chai 37oC trong khoảng 30-60 phút. - Bổ sung vào mỗi chai 40 ml môi trường không huyết thanh. - Ủ nuôi các chai trong tủ ấm 35-37oC từ 5-6 ngày.