a. Tách chiết ARN virút dengue
Sử dụng High Pure Viral RNA Kit của Roche với các bước thực hiện như sau:
- Hộn 200 µl mẫu hỗn dịch virút dengue với 400 µl Binding Buffer có bổ sung Poly (A) và chuyển vào High Pure Filter Tube.
- Ly tâm 8000xg trong 15s, loại bỏ Collection Tube chứa nước thải, chuyển High Pure Filter Tube sang Collection Tube mới.
- Bổ sung 500 µl Inhibitor Removal Buffer
- Ly tâm 8000xg trong 1 phút, loại bỏ Collection Tube chứa nước thải, chuyển High Pure Filter Tube sang Collection Tube mới.
- Bổ sung 450 µl Wash Buffer.
- Ly tâm 8000xg trong 1 phút, loại bỏ Collection Tube chứa nước thải, chuyển High Pure Filter Tube sang Collection Tube mới.
- Lặp lại 2 bước trên 1 lần nữa
- Bổ sung 50 µl Elution Buffer
56
- Dung dịch RNA tinh khiết của virút thu được có thể được cất giữ ở nhiệt độ âm sâu hoặc tiếp tục sử dụng trong tổng hợp cDNA.
- Hàm lượng RNA thu được có thể đọc bằng máy NanoDrop
b. Tổng hợp cDNA virút bằng hexamer primer ngẫu nhiên.
Sử dụng Superscript First-strand Synthesis System cho RT-PCR (Life Technologies) với các bước thực hiện như sau:
- Cho 7 µl RNA virút thu được + 2 µl hexamer ngẫu nhiên + 1 µl 10 mM dNTP vào tube.
- Ủ trong 5 phút tại 65oC và giữ trong tại 8oC ít nhất 1 phút.
- Chuẩn bị hỗn dịch phản ứng 2X với thành phần dưới đây vào 1 tube khác:
10X RT Buffer 2 µl
25 mM MgCl2 4 µl
0.1 M DTT 2 µl
RNaseOUT 1 µl
SuperScript II RT 1 µl
- Bổ sung 10 µl hỗn dịch phản ứng với hỗn dịch RNA/primer ở trên - Ủ tại 25oC trong 10 phút, 50oC trong 50 phút, 85oC trong 5 phút - Giữ hỗn dịch tại -20oC hoặc sử dụng ngay cho PCR.
c. Tổng hợp các đoạn DNA sợi kép một phần chùm lên nhau bao phủ toàn bộ bộ gen của virút (2000 – 2500 base mỗi sản phẩm) bằng PCR.
Sử dụng Advantage cDNA Polymerase kit từ Clontech + 10 mM dNTP
Thành phần trộn trong các tube PCR như sau:
40 µl water
5 µl 10X PCR buffer 1 µl 10 mM dNTP mix
1 µl primer pair (15 uM each primer) 1 µl polymerase
57 2 µl RT reaction
Đối với mỗi chủng dengue sử dụng 5 cặp mồi đặc hiệu để thu được 5 mảnh DNA chứa toàn bộ bộ gen chủng dengue đồng thời các mảnh thu được có những đoạn trùm lên nhau.
Thành phần đối chứng âm: 21 µl water 2.5 µl 10X PCR buffer 0.5 µl 10 mM dNTP mix 0.5 µl primer pair 0.5 µl polymerase
Chu trình nhiệt: 1X 94º 1 min 35X 94º 0.5 min
60º 0.5 min 68º 2 min 1X 68º 3 min 1X 8º hold
Chạy điện di kiểm tra kích thước và chất lượng sản phẩm sau PCR.
d. Làm sạch các sản phẩm PCR và giải trình tự.
- Làm sạch sản phẩm sau khi PCR bằng High Pure PCR product purification kit (ROCHE). Thu lại sản phẩm sau tinh sạch khoảng 100 µl.
- Sử dụng ABI BigDye v1.1 kit cùng các primer dengue phù hợp với thành phần như sau:
8 µl BigDye ready terminator mix 2 µl sản phẩm PCR (100 - 200 ng) 5 pmol primer
58
Chu trình nhiệt cho 25 chu kỳ: 96°C 10 sec 50° 5 sec
60° 4 min
4º hold
- Tiếp tục làm sạch sản phẩm sau PCR trên bằng Edge 96-well gel filtration kit
(Edge BioSystems). Sản phẩm bây giờ có thể được đưa trực tiếp vào máy giải trình tự hoặc cất ở 4oC.
59
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN