lượng tế bào Vero trên chai nuôi một lớp
Nguyên tắc
Tế bào Vero được cất giữ trong môi trường có huyết thanh và chất bảo quản DMSO, chất bảo quản này giúp cho tế bào không bị chết khi cất giữ ở nhiệt âm sâu (nitơ lỏng -196 °C), nhưng đồng thời cũng là chất có thể gây độc tế bào khi chuyển lại điều kiện nuôi cấy bình thường. Các ống tế bào sẽ được đông tan nhanh trong nước ấm (37oC) và chuyển vào trong môi trường nuôi cấy, môi trường với DMSO tồn dư được loại bỏ sau 1 ngày. Tế bào sau khi nhân lên phủ kín bề mặt chai sẽ được tách chuyển tiếp sang các chai nuôi mới.
Các bước tiến hành
49
- Hút chuyển 24 ml môi trường MEM 10%FBS vào chai nuôi tế bào 75cm2, làm ấm môi trường bằng bể ổn nhiệt tại 37oC, 10 phút.
- Lấy ống tế bào Vero bảo quản trong N2 lỏng, cho nhanh vào cốc nước 37oC. - Khi hỗn dịch trong ống tế bào tan hoàn toàn, hút toàn bộ hỗn dịch, từ từ
chuyển vào trong chai nuôi tế bào có môi trường đã được làm ấm. (Thực hiện trong tủ an toàn sinh học)
- Lắc nhẹ chai cho tế bào lan đều bề mặt, chuyển vào tủ ấm 37oC.
- Sau 24h, kiểm tra mức độ bám của tế bào Vero trên bề mặt chai, hút bỏ toàn bộ môi trường cũ (có chứa DMSO), chuyển 25ml môi trường MEM 10%FBS đã làm ấm vào các chai.
- Tiếp tục nuôi và theo tế bào tại 37oC từ 3-5 ngày.
b. Cấy chuyển, nhân thêm tế bào trên chai nuôi cấy một lớp
- Kiểm tra chai tế bào (nuôi từ 2-3 ngày) trước khi tiến hành: môi trường nuôi cấy trong suốt, màu đỏ cam, tế bào phủ kín 90-100% bề mặt. (Hình 9)
- Ủ ấm môi trường MEM 10%FBS, Trypsin và PBS trong 37oC từ 15 đến 30 phút.
- Chuyển các chai tế bào, dụng cụ và hóa chất vào trong tủ an toàn sinh học. - Hút sạch toàn bộ nước nổi trong các chai tế bào.
- Chuyển 10 ml PBS vào trong chai tế bào (75 cm2). Tráng rửa bề mặt rồi hút bỏ toàn bộ PBS.
- Lặp lại bước trên thêm 1 lần.
- Chuyển 1 ml dung dịch Trypsin 0.25% vào trong chai tế bào (75 cm2), láng đều bề mặt.
- Ủ các chai trong 37oC từ 3-5 phút, soi kính hiển vi kiểm tra tế bào tách khỏi bề mặt chai.
- Vỗ nhẹ vào thành chai cho tế bào tách hoàn toàn.
- Chuyển 9 ml môi trường MEM 10%FBS vào chai tế bào để trung hòa trypsin.
50
- Lấy mẫu hỗn dịch tế bào để đếm bằng buồng đếm tế bào. Tính mật độ tế bào trong hỗn dịch tế bào thu được.
- Chuyển tế bào trong hỗn dịch thu được vào mỗi chai nuôi cấy mới (75 cm2) từ 106 đến 2,5x106 tế bào.
- Thêm môi trường MEM 10%FBS vừa đủ đến 25 ml vào mỗi chai.
- Chuyển các chai nuôi cấy tế bào mới vào tủ ấm 37oC, theo dõi từ 2-3 ngày.
Hình 9. Tế bào Vero sau khi nuôi cấy. A: Sau 1 ngày, B: sau 2 ngày, C: Sau 3 ngày.