Tại công đoạn này, một số điều kiện đầu vào của quá trình chiết được cố định như sau: nhiệt độ phòng, thời gian 24 giờ, tỷ lệ DM:NL 20:1 (v/w). Những dung môi được nghiên cứu lựa chọn là: nước cất, ethanol 96%, n-hexan, ethyl acetate và chloroform.
Hình 2.3. Sơ đồ lựa chọn dung môi chiết 2.3.2.3. Xác định tỷ lệ dung môi thích hợp
Sau khi lựa chọn được dung môi chiết, tiến hành nghiên cứu lựa chọn tỷ lệ dung môi:nguyên liệu từ 20:1 đến 80:1 (v/w) với bước nhảy là 10:1 (v/w). Chiết ở nhiệt độ phòng và thời gian 24 giờ.
Hình 2.4. Sơ đồ lựa chọn tỷ lệ dung môi:nguyên liệu Nguyên liệu
20:1 30:1 40:1 50:1
Lựa chọn tỷ lệ dung môi thích hợp
Xác định hàm lượng polyphenol và đánh giá hoạt tính chống oxy hóa
70:1
60:1 80:1
Nguyên liệu
H2O ethanol n-hexan Clorofrom
Xác định hàm lượng polyphenol và hoạt tính
chống oxy hóa Lựa chọn dung môi thích
hợp EtOAC
3.3.2.4. Xác định thời gian chiết thích hợp
Chiết polyphenol từ thân cây bắp trong các điều kiện được lựa chọn ở công đoạn trên. Khoảng thời gian được nghiên cứu là 16 đến 48 giờ với bước nhảy là 8 giờ.
Hình 2.5. Sơ đồ lựa chọn thời gian chiết thích hợp
3.3.2.5. Xác định nhiệt độ chiết thích hợp
Nhiệt độ chiết được nghiên cứu là nhiệt độ phòng, 400C đến 800C với bước nhảy là 100C. Các điều kiện đầu vào khác được lựa chọn ở công đoạn trên.
Hình 2.6. Sơ đồ lựa chọn nhiệt độ chiết thích hợp Nguyên liệu
24 giờ 32 giờ 40 giờ 48 giờ
Lựa chọn thời gian chiết thích hợp
Xác định hàm lượng polyphenol và hoạt tính chống oxy hóa 16 giờ
Nguyên liệu
Nhiệt độ phòng 400
C 500C 600 700C 800C
Xác định hàm lượng polyphenol và hoạt tính chống oxy hóa Lựa chọn nhiệt độ thích hợp
2.3.2.6. Xác định pH thích hợp
Chiết polyphenol từ thân cây bắp ở các điều kiện chiết ở trên và khoảng pH nghiên cứu là 3 đến 9 với bước nhảy là 1.
Hình 2.7. Sơ đồ lựa chọn pH chiết thích hợp 2.3.2.7. Xác định số lần chiết
Tiến hành trích ly mẫu ở điều kiện đã khảo sát ở trên. Sau khi trích ly 1 lần xong thì tiến hành lọc thu lấy dịch lọc. Phần bã tiếp tục được sử dụng để trích ly lại (lần 2) ở các điều kiện tương tự như trích ly lần 1. Việc trích ly được lặp lại 2 lần trên cùng một mẫu. Sau khi lọc thu dịch chiết xác định hàm lượng polyphenol và hoạt tính chống oxy hóa.
Hình 2.8. Sơ đồ lựa chọn số lần chiết thích hợp Nguyên liệu
Lần 1 Lần 2
Lựa chọn số lần chiết phù hợp Đánh giá hàm lượng polyphenol và hoạt tính
chống oxy hóa Nguyên liệu
3
Lựa chọn pH thích hợp Xác định hàm lượng polyphenol
và hoạt tính chống oxy hóa
2.3.3. Bố trí thí nghiệm thử nghiệm sản xuất đồ uống 2.3.3.1. Xác định tỷ lệ sacchrose bổ sung vào đồ uống 2.3.3.1. Xác định tỷ lệ sacchrose bổ sung vào đồ uống Cố định thông số các yếu tố như sau:
o Citric acid: 0,07% o Carrageenan : 0,05% o Ascorbic acid: 0,04 % o Polyphenol: 12,5mg
o Phối trộn ở nhiệt độ 400C, thời gian 3 phút
o Thanh trùng Pasteur ở nhiệt độ 900C trong 17 phút.
Bố trí thí nghiệm với 5 mẫu với các tỷ lệ saccharose lần lượt là 6%, 9%, 12%, 15% và 18% như sơ đồ bố trí. Với bước nhảy là 3% saccharose, năm mẫu được tiến hành phối trộn ở nhiệt độ và thời gian như đã cố định ở trên. Sau khi phối trộn mẫu được đem đi thanh trùng, làm nguội và tiến hành đánh giá cảm quan.
Hình 2.9. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ saccharose bổ sung thích hợp 2.3.3.2. Xác định tỷ lệ acid citric bổ sung vào đồ uống
Cố định thông số các yếu tố như sau: o Carrageenan: 0,05%
o Ascorbic acid: 0,04% o Polyphenol: 12,5mg
o Phối trộn ở nhiệt độ 400C, thời gian 3 phút
o Thanh trùng Pasteur ở nhiệt độ 900C trong 17 phút. Các thông số khác được lựa chọn từ kết quả nghiên cứu trên.
Saccharose
6% 9% 12% 15% 18%
Đồ uống
Đánh giá cảm quan chọn ra tỷ lệ saccharose thích hợp
Bố trí thí nghiệm với 5 mẫu thí nghiệm với 5 tỷ lệ acid citric lần lượt là 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08% và 0,09%. Mẫu sau khi phối trộn được đem đi thanh trùng, làm nguội rồi được đánh giá cảm quan.
Hình 2.10. Bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ acid citric bổ sung thích hợp 2.3.3.3. Xác định tỷ lệ carrageenan bổ sung thích hợp vào đồ uống Cố định các thông số:
o Ascorbic acid: 0,04% o Polyphenol: 12,5mg
o Phối trộn ở nhiệt độ 400C, thời gian 3 phút
o Thanh trùng Pasteur ở nhiệt độ 900C trong 17 phút. Các thông số khác được lựa chọn từ kết quả nghiên cứu trên.
Bố trí thí nghiệm với 5 mẫu với các tỷ lệ carrageenan bổ sung là 0,03%, 0,04%, 0.05%, 0,06% và 0,07%. Mẫu sau khi phối trộn được đem đi thanh trùng, làm nguội rồi được đánh giá cảm quan.
Hình 2.11. Bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ carrageenan bổ sung thích hợp Carrageenan 0,03% 0,04% 0,05% 0,06% 0,07% Đồ uống Đánh giá cảm quan chọn ra tỷ lệ Carrageenan thích hợp Đồ uống 0,08% 0,07% 0,06% 0,05% 0,09% Acid citric Đánh giá cảm quan chọn ra tỷ lệ acid citric thích hợp
2.3.3.4. Xác định tỷ lệ acid ascorbic bổ sung thích hợp vào đồ uốngCố định các thông số: Cố định các thông số:
o Polyphenol: 12,5mg
o Phối trộn ở nhiệt độ 400C, thời gian 3 phút
o Thanh trùng Pasteur ở nhiệt độ 900C trong 17 phút. Các thông số khác được lựa chọn từ kết quả nghiên cứu trên.
Bố trí thí nghiệm với 5 mẫu với các tỷ lệ acid ascorbic bổ sung 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05% và 0,06%. Mẫu sau khi phối trộn được đem đi thanh trùng, làm nguội rồi được đánh giá cảm quan.
Hình 2.12. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ acid ascorbic bổ sung thích hợp
2.3.3.5. Xác định hàm lượng polyphenol bổ sung thích hợp vào đồ uốngCố định các thông số: Cố định các thông số:
o Phối trộn ở nhiệt độ 400C, thời gian 3 phút
o Thanh trùng Pasteur ở nhiệt độ 900C trong 17 phút. Các thông số khác được lựa chọn từ kết quả nghiên cứu trên.
Bố trí thí nghiệm với 5 mẫu với các hàm lượng polyphenol bổ sung 7,5mg, 10mg, 12,5mg, 15mg và 17,5mg. Mẫu sau khi phối trộn được đem đi thanh trùng, làm nguội rồi được đánh giá cảm quan.
Acid ascorbic 0,02% 0,03% 0,04% 0,05% 0,06% Đồ uống Đánh giá cảm quan chọn ra tỷ lệ acid ascorbic thích hợp
Hình 2.13. Bố trí thí nghiệm xác định hàm lượng polyphenol bổ sung
2.3.3.6. Xác định nhiệt độ và thời gian phối trộn thích hợp
Sau khi tiến hành xác định tỷ lệ các nguyên liệu được ưa thích nhất ta tiến hành xác định nhiệt độ và thời gian phối trộn.
Hình 2.14. Bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ và thời gian phối trộn thích hợp Polyphenol 7,5mg mg 10mg mg 15mg mg 12,5mg mg 17,5mg mg Đồ uống Đánh giá cảm quan chọn ra hàm lượng polyphenol thích hợp
Dịch chiết chứa polyphenol
Thời gian Phối trộn Nhiệt độ
Đánh giá cảm quan, hoạt tính chống oxy hóa Nguyên liệu phụ
1 2 3 4 5 RT 40 45 50
Chọn nhiệt độ và thời gian phối trộn thích hợp
2.3.3.7. Xác định thời gian thanh trùng thích hợp
Sản phẩm được thanh trùng ở 900C, thời gian thanh trùng được khảo sát trong khoảng 17 phút, 18 phút và 19 phút. Với bước nhảy 1 phút. Các điều kiện đầu vào được khảo sát ở trên. Sau khi thanh trùng đem đi đánh giá cảm quan và xác định hoạt tính chống oxy hóa của polyphenol.
Hình 2.15. Sơ đồ lựa chọn thời gian thanh trùng thích hợp 2.3.3.8. Xác định thời gian bảo quản thích hợp
Thời gian bảo quản được khảo sát trong khoảng 1 tháng đến 6 tháng. Với bước nhảy 1 tháng. Các điều kiện đầu vào được khảo sát ở trên.
Hình 2.16. Sơ đồ lựa chọn thời gian bảo quản thích hợp Dịch chiết chứa polyphenol
Thời gian Phối trộn Thanh trùng Nguyên liệu phụ 17 19 Đánh giá cảm quan, xác định hoạt tính chống oxy hóa Xác định thời gian thanh trùng thích hợp 18 Bảo quản 3 tháng 2 tháng 1 tháng 4 tháng Xác định hàm lượng polyphenol và hoạt tính chống oxy hóa, độ
màu, cảm quan Thời gian bảo quản
2.4. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ CHỦ YẾU ĐÃ SỬ DỤNG2.4.1. Hóa chất 2.4.1. Hóa chất
Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu: HCl, NaOH, Na2CO3, H2SO4, sodium phosphate, ammonium Molybdate, đệm phosphate pH = 7,2, K3[Fe(CN)6], CCl3COOH, FeCl3, FeSO4, DPPH, n-hexan, ethyl acetate và chloroform đều là các hóa chất tinh khiết đạt tiêu chuẩn dùng cho phân tích do Merck - Đức cung cấp. Ethanol 960 của Việt Nam, acid citric, acid ascorbic, carrageenan, saccharose của Trung Quốc.
2.4.2. Thiết bị chủ yếu đã sử dụng
Sử dụng các thiết bị chủ yếu có trong phòng thí nghiệm Hóa phân tích và Chuyển giao công nghệ của Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang bao gồm: nồi autocla tự chế, máy đo pH HANA của Mỹ, máy Elisa của hãng BioTek Mỹ.
2.5. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU
Phân tích ANOVA và thống kê bằng phần mềm MS. Excell 2010. Loại bỏ giá trị bất thường bằng phương pháp Dulcan. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần.
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. ĐÁNH GIÁ HÀM LƯỢNG POLYPHENOL CÓ TRONG CÁC BỘ PHẬN THÂN, RỄ VÀ RÂU BẮP PHẬN THÂN, RỄ VÀ RÂU BẮP
Tiến hành 3 mẫu thí nghiệm chiết rút polyphenol từ các bộ phận khác nhau của cây bắp: Mẫu 1: chiết rút polyphenol từ thân, Mẫu 2: chiết rút polyphenol từ rễ và Mẫu 3: chiết rút polyphenol từ râu bắp. Các mẫu đều sử dụng cùng một lượng nguyên liệu: 100g. Quá trình chiết rút polyphenol từ các phần của cây bắp được thực hiện ở nhiệt độ phòng và sử dụng dung môi Ethanol 96% để chiết rút trong thời gian 24 giờ với tỷ lệ DM:NL là 20:1 (v/w). Sau khi chiết rút, lọc thu dịch chiết và tiến hành đánh giá hàm lượng polyphenol, hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết thu được. Kết quả đánh giá được trình bày ở các hình 3.1, 3.2 và 3.3.
Hình 3.1. Sự thay đổi hàm lượng polyphenol của dịch chiết thu nhận từ rễ, râu và thân bắp
Hình 3.2. Sự thay đổi hoạt tính chống oxy hóa tổng của dịch chiết thu nhận từ rễ, râu và thân bắp
Hình 3.3. Sự thay đổi hoạt tính khử Fe của dịch chiết thu nhận từ rễ, râu và thân bắp Từ các kết quả phân tích ở các hình 3.1, 3.2 và 3.3 cho thấy:
+ Về hàm lượng polyphenol
Kết quả phân tích cho thấy dịch chiết trong ethanol 96% của các bộ phận khác nhau của cây bắp có chứa hàm lượng polyphenol với hoạt tính chống oxy hóa khác nhau. Trong đó dịch chiết từ thân bắp có hàm lượng polyphenol cao nhất và đạt mức 2,413 (g acid gallic/100g mẫu). Trong khi đó, dịch chiết từ rễ và râu bắp có hàm lượng polyphenol thấp hơn và chỉ đạt tương ứng 1,763 và 1,312 (g acid gallic/100g mẫu), chỉ bằng tương ứng 73,06% và 54,37% hàm lượng polyphenol có trong dịch chiết từ thân bắp. Kết quả này chứng tỏ thân cây bắp có hàm lượng polyphenol cao hơn các bộ phận khác như rễ và râu bắp.
+ Về hoạt tính chống oxy hóa - Hoạt tính chống oxy hóa tổng
Kết quả phân tích cho thấy cũng giống hàm lượng polyphenol, hoạt tính chống oxy hóa tổng có trong dịch chiết từ thân bắp cũng cao hơn hoạt tính chống oxy hóa tổng có trong dịch chiết từ rễ và râu bắp (hình 3.2). Hoạt tính chống oxy hóa tổng của dịch chiết từ thân cao nhất và đạt 5,354g acid ascorbic/100g mẫu. Trong khi đó, hoạt tính chống oxy hóa tổng của dịch chiết trong ethanol 96% thu nhận từ rễ và râu bắp có khác nhau chút ít. Hoạt tính chống oxy hóa tổng của dịch chiết thu nhận từ rễ và râu bắp chỉ đạt tương ứng 3,149g acid ascorbic/100g mẫu và 3,158g acid ascorbic/100g mẫu, chỉ bằng tương ứng 58,82% và 58,98% so với hoạt tính chống oxy hóa tổng của dịch chiết thu nhận từ thân bắp. Kết quả phân tích ANOVA về hoạt tính chống oxy hóa tổng của dịch chiết từ rễ và râu bắp cho thấy không có sự khác biệt mang tính thống kê về hoạt tính chống oxy hóa tổng của dịch chiết từ rễ và dịch chiết từ râu.
- Hoạt tính khử Fe
Kết quả phân tích ở hình 3.3 cho thấy cũng giống hàm lượng polyphenol và hoạt tính chống oxy hóa tổng, hoạt tính khử sắt của dịch chiết thu nhận từ thân bắp cao hơn hoạt tính khử sắt của dịch chiết thu nhận từ râu và rễ bắp. Hoạt tính khử sắt của dịch chiết thu nhận từ thân cao nhất và đạt mức 11,762g FeSO4/100g mẫu. Trong khi đó, hoạt tính khử sắt của dịch chiết thu nhận từ rễ và râu bắp chỉ đạt tương ứng 7,262g FeSO4/100g mẫu và 7,048g FeSO4/100g mẫu. Như vậy hoạt tính khử sắt của dịch chiết thu nhận từ rễ và râu bắp chỉ bằng 61,74% và 59,92% so với hoạt tính khử sắt của dịch chiết thu nhận từ thân bắp. Kết quả phân tích ANOVA cũng cho thấy hoạt tính khử sắt của polyphenol ở râu, rễ và thân có sự khác biệt mang tính thống kê (F > Fcrit).
Từ các phân tích ở trên cho thấy thân bắp chứa hàm lượng polyphenol với hoạt tính chống oxy hóa cao nhất, cao hơn nhiều so với hàm lượng polyphenol của dịch chiết thu nhận từ râu và rễ bắp. Do vậy, thân bắp được lựa chọn làm nguyên liệu chiết rút polyphenol.
3.2. XÁC ĐỊNH CÁC ĐIỀU KIỆN THÍCH HỢP CHO QUÁ TRÌNH CHIẾT RÚT POLYPHENOL TỪ THÂN BẮP CHIẾT RÚT POLYPHENOL TỪ THÂN BẮP
3.2.1. Xác định dung môi chiết thích hợp
Tiến hành 5 mẫu thí nghiệm sử dụng các loại dung môi khác nhau để chiết rút polyphenol từ thân của cây bắp: Mẫu 1: sử dụng nước cất, Mẫu 2: sử dụng ethanol 96%, Mẫu 3: sử dụng ethyl acetate, Mẫu 4: sử dụng n-hexan và Mẫu 5: sử dụng chloroform. Các mẫu đều sử dụng cùng một lượng nguyên liệu: 100g thân bắp khô. Quá trình chiết rút polyphenol được thực hiện ở nhiệt độ phòng, trong thời gian 24 giờ với tỷ lệ DM:NL là 20:1 (v/w). Sau khi chiết rút, lọc thu dịch chiết và tiến hành đánh giá hàm lượng polyphenol, hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết thu được. Kết quả đánh giá được trình bày ở các hình 3.4, hình 3.5 và 3.6.
Hình 3.4. Ảnh hưởng của dung môi chiết đến hàm lượng polyphenol của dịch chiết thu nhận từ thân bắp
Hình 3.5. Ảnh hưởng của dung môi chiết đến hoạt tính chống oxy hóa tổng của dịch chiết thu nhận từ thân bắp
Hình 3.6. Ảnh hưởng của dung môi chiết đến hoạt tính khử Fe của dịch chiết thu nhận từ thân bắp
Từ các kết quả phân tích ở các hình 3.4 ÷3.6 cho thấy: + Về hàm lượng polyphenol
Kết quả nghiên cứu cho thấy khi sử dụng các loại dung môi khác nhau để chiết polyphenol từ thân bắp thì hàm lượng polyphenol của dịch chiết bằng các dung môi khác nhau cũng khác nhau. Trong số các dung môi (nước cất, ethanol, ethyl acetate, n-hexan và chloroform) đã sử dụng để chiết polyphenol từ thân bắp thì nước là dung môi cho dịch chiết có hoạt tính chống oxy hóa cao nhất và đạt 2,558g acid gallic/100g mẫu (hình 3.4). Dịch chiết trong ethanol, ethyl acetate, n-hexan và chloroform đều có hàm lượng polyphenol thấp hơn so với hàm lượng polyphenol của dịch chiết nước chỉ
đạt tương ứng 2,413, 1,093, 0,439 và 0,398 (g acid gallic/100g mẫu), chỉ bằng tương ứng 94,33%, 42,72%, 17,16% và 15,56% hàm lượng polyphenol của dịch chiết trong nước. Kết quả này chứng tỏ nước là dung môi phù hợp cho quá trình chiết polyphenol từ thân bắp. Kết quả này có thể lý giải là do đặc tính cấu trúc của polyphenol có chứa nhiều nhóm có cực nên có khả năng tan tốt trong nước hơn là các dung môi hữu cơ có cực như ethanol hoặc không có cực như ethyl acetate, n-hexan và chloroform. Kết quả này phù hợp với Angshuman và cộng sự khi nghiên cứu chiết polyphenol từ trà [23] và Wen-Ying Huang và cộng sự với nghiên cứu tác dụng của dung môi nước trong tách chiết polypenol từ trà [79].