chống oxy hóa
- Phương pháp thu mẫu: Cây bắp được lấy ngẫu nhiên trên cùng một thửa 2.000 m2. - Xử lý mẫu: sấy lạnh mẫu ở 500C đến hàm ẩm 19% và xay nhỏ tới kích thước 2- 4mm và bảo quản mẫu đã xay nhỏ ở 100C để tiến hành nghiên cứu.
- Phương pháp chiết được sử dụng là phương pháp ngâm dầm. - Mỗi nghiệm thức sử dụng 100g mẫu khô để nghiên cứu. 2.2.2. Phương pháp phân tích cảm quan
Đánh giá cảm quan theo phương pháp cho điểm được quy định trong tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN 3215 - 79). Sử dụng hệ điểm 20, thang điểm 6 bậc (từ 0 đến 5) và điểm cao nhất cho mỗi chỉ tiêu là 5 điểm, trong đó điểm 0 ứng với chất lượng sản phẩm “bị hỏng”, còn từ điểm 1 đến điểm 5 ứng với mức khuyết tật giảm dần. Ở điểm 5 sản phẩm coi như không có sai lỗi và khuyết tật nào, trong tính chất đang xét, sản phẩm có tính tốt đặc trưng và rõ rệt cho chỉ tiêu đó. Hội đồng phải gồm từ 5 đến 12 người chuyên gia có hiểu biết về sản phẩm được đánh giá. Hội đồng có chủ tịch và thư ký để lãnh đạo hội đồng trong quá trình làm việc. Theo hệ điểm 20, chất lượng sản phẩm được chia ra 6 mức theo bảng sau:
Bảng 2.1: Các mức chất lượng
Mức Điểm Điểm trung bình chưa có trọng lượng Tốt 18,6 ÷ 20,0 Các chỉ tiêu quan trọng nhất ≥ 4,7 Khá 15,2 ÷ 18,5 Các chỉ tiêu quan trọng nhất ≥ 3,8 Trung bình 11,2 ÷ 15,1 Mỗi chỉ tiêu ≥ 2,8
Kém 7,2 ÷ 11,1 Mỗi chỉ tiêu ≥ 1,8
Rất kém 4,0 ÷ 7,1 Mỗi chỉ tiêu ≥ 1,0
Sản phẩm đạt chất lượng khi điểm trung bình chưa có trọng lượng của mộtchỉ tiêu bất kỳ phải đạt nhỏ nhất là 2,8 và điểm chất lượng không nhỏ hơn 11,2. Nếu hội đồng thống nhất đánh cho một chỉ tiêu nào đó 0 điểm thì điểm chung bằng 0 và sản phẩm coi như hỏng. Nếu thành viên nào cho điểm lệch quá 1,5 điểm trung bình chưa có trọng lượng của hội đồng thì điểm của thành viên đó bị loại.
Bảng 2.2. Hệ số quan trọng các chỉ tiêu Chỉ tiêu Hệ số quan trọng Màu 1,2 Mùi 0,8 Vị 1,0 Trạng thái 1,0 2.2.3. Phương pháp phân tích
2.2.3.1. Phương pháp định lượng polyphenol
Định lượng polyphenol theo phương pháp của Swanson và cộng sự (2002) [73]. 2.2.3.2. Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa
- Hoạt tính chống oxy hóa tổng (TA) được xác định theo phương pháp của Prieto và cộng sự (1999) [60].
- Hoạt tính khử Fe (RP) được xác định theo phương pháp của Zhu và cộng sự (2002) [82].
- Hoạt tính bắt gốc tự do DPPH: tiến hành theo phương pháp của Blois và cộng sự (1958) [27].
2.2.3.3. Phương pháp xác định độ ẩm:
Độ ẩm của mẫu được xác định theo phương pháp sấy khô đến trọng lượng không đổi ở 1050C theo TCVN 5613 : 1991 [14].
2.2.4. Phương pháp phân tích vi sinh vật
- Xác định Coliform theo TCVN 6262-1:1997 [15].
- Xác định tổng số bào tử nấm men - nấm mốc theo TCVN 7137:2002 [16]. - Xác định Staphylococcus aureus theo TCVN 4830-1:2005 [18].
- Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí theo TCVN 4884:2005 [17]. - Xác định Samonella theo TCVN 6402:2007 [20].
- Xác định Escherichia coli theo TCVN 6505-1:2007 [19]. 2.2.5. Phương pháp xác định độ màu
Độ màu của sản phẩm được xác định theo phương pháp của Neslihan Alper và cộng sự (2005) [53].
2.3. PHƯƠNG PHÁP BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM
2.3.1. Quy trình dự kiến thu nhận polyphenol từ bắp và thử nghiệm sử dụng polyphenol từ bắp trong sản xuất đồ uống polyphenol từ bắp trong sản xuất đồ uống
Hình 2.1. Quy trình dự kiến thu nhận polyphenol và sản xuất đồ uống Nguyên liệu Sấy khô Xay nhỏ Rửa Chiết Lọc Dịch lọc Đóng hộp Bảo quản Bã Saccharose Carrageenan Citric acid Ascorbic acid Thanh trùng Phối trộn Cô đặc
Thuyết minh quy trình
Nguyên liệu: râu, rễ, thân của cây bắp
Rửa: nhằm loại bỏ tạp chất dính trên cây bắp
Sấy khô: bảo quản dễ dàng và thuận lợi cho quá trình xay nhỏ Xay nhỏ: tăng diện tích tiếp xúc của dung môi và nguyên liệu
Chiết: nhằm tách polyphenol với hoạt tính chống oxy hóa ra khỏi nguyên liệu Lọc: loại bỏ bã và thu dịch chiết chứa polyphenol hoạt tính
Cô đặc: làm giàu polyphenol trong dịch chiết thu được
Phối trộn/đồng hóa: bổ sung thêm thành phần vào dịch để tạo ra đồ uống và tạo ra sự đồng nhất cho chế phẩm
Đóng hộp: đóng hộp dịch lọc sau khi phối trộn/ đồng hóa Thanh trùng: nhằm tăng thời gian bảo quản của sản phẩm Bảo quản: nhằm tăng thời gian lưu chuyển sản phẩm 2.3.2. Bố trí thí nghiệm chiết polyphenol từ cây bắp 2.3.2.1. Khảo sát hàm lượng polyphenol
Tiến hành khảo sát hàm lượng polyphenol và hoạt tính chống oxy hóa từ thân, rễ, râu của cây bắp. Mỗi loại cân 100g, chiết trong dung môi ethanol 96%, thời gian 24h, nhiệt độ phòng, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (DM/NL) 20/1 (v/w). Sau đó đem đi lọc và xác định hàm lượng polyphenol, hoạt tính chống oxy hóa.
Hình 2.2. Sơ đồ lựa chọn nguyên liệu thích hợp Chiết
Xác định hàm lượng polyphenol và hoạt tính chống oxy hóa
Râu Thân Rễ
Chọn nguyên liệu thích hợp
2.3.2.2. Xác định dung môi chiết
Tại công đoạn này, một số điều kiện đầu vào của quá trình chiết được cố định như sau: nhiệt độ phòng, thời gian 24 giờ, tỷ lệ DM:NL 20:1 (v/w). Những dung môi được nghiên cứu lựa chọn là: nước cất, ethanol 96%, n-hexan, ethyl acetate và chloroform.
Hình 2.3. Sơ đồ lựa chọn dung môi chiết 2.3.2.3. Xác định tỷ lệ dung môi thích hợp
Sau khi lựa chọn được dung môi chiết, tiến hành nghiên cứu lựa chọn tỷ lệ dung môi:nguyên liệu từ 20:1 đến 80:1 (v/w) với bước nhảy là 10:1 (v/w). Chiết ở nhiệt độ phòng và thời gian 24 giờ.
Hình 2.4. Sơ đồ lựa chọn tỷ lệ dung môi:nguyên liệu Nguyên liệu
20:1 30:1 40:1 50:1
Lựa chọn tỷ lệ dung môi thích hợp
Xác định hàm lượng polyphenol và đánh giá hoạt tính chống oxy hóa
70:1
60:1 80:1
Nguyên liệu
H2O ethanol n-hexan Clorofrom
Xác định hàm lượng polyphenol và hoạt tính
chống oxy hóa Lựa chọn dung môi thích
hợp EtOAC
3.3.2.4. Xác định thời gian chiết thích hợp
Chiết polyphenol từ thân cây bắp trong các điều kiện được lựa chọn ở công đoạn trên. Khoảng thời gian được nghiên cứu là 16 đến 48 giờ với bước nhảy là 8 giờ.
Hình 2.5. Sơ đồ lựa chọn thời gian chiết thích hợp
3.3.2.5. Xác định nhiệt độ chiết thích hợp
Nhiệt độ chiết được nghiên cứu là nhiệt độ phòng, 400C đến 800C với bước nhảy là 100C. Các điều kiện đầu vào khác được lựa chọn ở công đoạn trên.
Hình 2.6. Sơ đồ lựa chọn nhiệt độ chiết thích hợp Nguyên liệu
24 giờ 32 giờ 40 giờ 48 giờ
Lựa chọn thời gian chiết thích hợp
Xác định hàm lượng polyphenol và hoạt tính chống oxy hóa 16 giờ
Nguyên liệu
Nhiệt độ phòng 400
C 500C 600 700C 800C
Xác định hàm lượng polyphenol và hoạt tính chống oxy hóa Lựa chọn nhiệt độ thích hợp
2.3.2.6. Xác định pH thích hợp
Chiết polyphenol từ thân cây bắp ở các điều kiện chiết ở trên và khoảng pH nghiên cứu là 3 đến 9 với bước nhảy là 1.
Hình 2.7. Sơ đồ lựa chọn pH chiết thích hợp 2.3.2.7. Xác định số lần chiết
Tiến hành trích ly mẫu ở điều kiện đã khảo sát ở trên. Sau khi trích ly 1 lần xong thì tiến hành lọc thu lấy dịch lọc. Phần bã tiếp tục được sử dụng để trích ly lại (lần 2) ở các điều kiện tương tự như trích ly lần 1. Việc trích ly được lặp lại 2 lần trên cùng một mẫu. Sau khi lọc thu dịch chiết xác định hàm lượng polyphenol và hoạt tính chống oxy hóa.
Hình 2.8. Sơ đồ lựa chọn số lần chiết thích hợp Nguyên liệu
Lần 1 Lần 2
Lựa chọn số lần chiết phù hợp Đánh giá hàm lượng polyphenol và hoạt tính
chống oxy hóa Nguyên liệu
3
Lựa chọn pH thích hợp Xác định hàm lượng polyphenol
và hoạt tính chống oxy hóa
2.3.3. Bố trí thí nghiệm thử nghiệm sản xuất đồ uống 2.3.3.1. Xác định tỷ lệ sacchrose bổ sung vào đồ uống 2.3.3.1. Xác định tỷ lệ sacchrose bổ sung vào đồ uống Cố định thông số các yếu tố như sau:
o Citric acid: 0,07% o Carrageenan : 0,05% o Ascorbic acid: 0,04 % o Polyphenol: 12,5mg
o Phối trộn ở nhiệt độ 400C, thời gian 3 phút
o Thanh trùng Pasteur ở nhiệt độ 900C trong 17 phút.
Bố trí thí nghiệm với 5 mẫu với các tỷ lệ saccharose lần lượt là 6%, 9%, 12%, 15% và 18% như sơ đồ bố trí. Với bước nhảy là 3% saccharose, năm mẫu được tiến hành phối trộn ở nhiệt độ và thời gian như đã cố định ở trên. Sau khi phối trộn mẫu được đem đi thanh trùng, làm nguội và tiến hành đánh giá cảm quan.
Hình 2.9. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ saccharose bổ sung thích hợp 2.3.3.2. Xác định tỷ lệ acid citric bổ sung vào đồ uống
Cố định thông số các yếu tố như sau: o Carrageenan: 0,05%
o Ascorbic acid: 0,04% o Polyphenol: 12,5mg
o Phối trộn ở nhiệt độ 400C, thời gian 3 phút
o Thanh trùng Pasteur ở nhiệt độ 900C trong 17 phút. Các thông số khác được lựa chọn từ kết quả nghiên cứu trên.
Saccharose
6% 9% 12% 15% 18%
Đồ uống
Đánh giá cảm quan chọn ra tỷ lệ saccharose thích hợp
Bố trí thí nghiệm với 5 mẫu thí nghiệm với 5 tỷ lệ acid citric lần lượt là 0,05%, 0,06%, 0,07%, 0,08% và 0,09%. Mẫu sau khi phối trộn được đem đi thanh trùng, làm nguội rồi được đánh giá cảm quan.
Hình 2.10. Bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ acid citric bổ sung thích hợp 2.3.3.3. Xác định tỷ lệ carrageenan bổ sung thích hợp vào đồ uống Cố định các thông số:
o Ascorbic acid: 0,04% o Polyphenol: 12,5mg
o Phối trộn ở nhiệt độ 400C, thời gian 3 phút
o Thanh trùng Pasteur ở nhiệt độ 900C trong 17 phút. Các thông số khác được lựa chọn từ kết quả nghiên cứu trên.
Bố trí thí nghiệm với 5 mẫu với các tỷ lệ carrageenan bổ sung là 0,03%, 0,04%, 0.05%, 0,06% và 0,07%. Mẫu sau khi phối trộn được đem đi thanh trùng, làm nguội rồi được đánh giá cảm quan.
Hình 2.11. Bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ carrageenan bổ sung thích hợp Carrageenan 0,03% 0,04% 0,05% 0,06% 0,07% Đồ uống Đánh giá cảm quan chọn ra tỷ lệ Carrageenan thích hợp Đồ uống 0,08% 0,07% 0,06% 0,05% 0,09% Acid citric Đánh giá cảm quan chọn ra tỷ lệ acid citric thích hợp
2.3.3.4. Xác định tỷ lệ acid ascorbic bổ sung thích hợp vào đồ uốngCố định các thông số: Cố định các thông số:
o Polyphenol: 12,5mg
o Phối trộn ở nhiệt độ 400C, thời gian 3 phút
o Thanh trùng Pasteur ở nhiệt độ 900C trong 17 phút. Các thông số khác được lựa chọn từ kết quả nghiên cứu trên.
Bố trí thí nghiệm với 5 mẫu với các tỷ lệ acid ascorbic bổ sung 0,02%, 0,03%, 0,04%, 0,05% và 0,06%. Mẫu sau khi phối trộn được đem đi thanh trùng, làm nguội rồi được đánh giá cảm quan.
Hình 2.12. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ acid ascorbic bổ sung thích hợp
2.3.3.5. Xác định hàm lượng polyphenol bổ sung thích hợp vào đồ uốngCố định các thông số: Cố định các thông số:
o Phối trộn ở nhiệt độ 400C, thời gian 3 phút
o Thanh trùng Pasteur ở nhiệt độ 900C trong 17 phút. Các thông số khác được lựa chọn từ kết quả nghiên cứu trên.
Bố trí thí nghiệm với 5 mẫu với các hàm lượng polyphenol bổ sung 7,5mg, 10mg, 12,5mg, 15mg và 17,5mg. Mẫu sau khi phối trộn được đem đi thanh trùng, làm nguội rồi được đánh giá cảm quan.
Acid ascorbic 0,02% 0,03% 0,04% 0,05% 0,06% Đồ uống Đánh giá cảm quan chọn ra tỷ lệ acid ascorbic thích hợp
Hình 2.13. Bố trí thí nghiệm xác định hàm lượng polyphenol bổ sung
2.3.3.6. Xác định nhiệt độ và thời gian phối trộn thích hợp
Sau khi tiến hành xác định tỷ lệ các nguyên liệu được ưa thích nhất ta tiến hành xác định nhiệt độ và thời gian phối trộn.
Hình 2.14. Bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ và thời gian phối trộn thích hợp Polyphenol 7,5mg mg 10mg mg 15mg mg 12,5mg mg 17,5mg mg Đồ uống Đánh giá cảm quan chọn ra hàm lượng polyphenol thích hợp
Dịch chiết chứa polyphenol
Thời gian Phối trộn Nhiệt độ
Đánh giá cảm quan, hoạt tính chống oxy hóa Nguyên liệu phụ
1 2 3 4 5 RT 40 45 50
Chọn nhiệt độ và thời gian phối trộn thích hợp
2.3.3.7. Xác định thời gian thanh trùng thích hợp
Sản phẩm được thanh trùng ở 900C, thời gian thanh trùng được khảo sát trong khoảng 17 phút, 18 phút và 19 phút. Với bước nhảy 1 phút. Các điều kiện đầu vào được khảo sát ở trên. Sau khi thanh trùng đem đi đánh giá cảm quan và xác định hoạt tính chống oxy hóa của polyphenol.
Hình 2.15. Sơ đồ lựa chọn thời gian thanh trùng thích hợp 2.3.3.8. Xác định thời gian bảo quản thích hợp
Thời gian bảo quản được khảo sát trong khoảng 1 tháng đến 6 tháng. Với bước nhảy 1 tháng. Các điều kiện đầu vào được khảo sát ở trên.
Hình 2.16. Sơ đồ lựa chọn thời gian bảo quản thích hợp Dịch chiết chứa polyphenol
Thời gian Phối trộn Thanh trùng Nguyên liệu phụ 17 19 Đánh giá cảm quan, xác định hoạt tính chống oxy hóa Xác định thời gian thanh trùng thích hợp 18 Bảo quản 3 tháng 2 tháng 1 tháng 4 tháng Xác định hàm lượng polyphenol và hoạt tính chống oxy hóa, độ
màu, cảm quan Thời gian bảo quản
2.4. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ CHỦ YẾU ĐÃ SỬ DỤNG2.4.1. Hóa chất 2.4.1. Hóa chất
Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu: HCl, NaOH, Na2CO3, H2SO4, sodium phosphate, ammonium Molybdate, đệm phosphate pH = 7,2, K3[Fe(CN)6], CCl3COOH, FeCl3, FeSO4, DPPH, n-hexan, ethyl acetate và chloroform đều là các hóa chất tinh khiết đạt tiêu chuẩn dùng cho phân tích do Merck - Đức cung cấp. Ethanol 960 của Việt Nam, acid citric, acid ascorbic, carrageenan, saccharose của Trung Quốc.
2.4.2. Thiết bị chủ yếu đã sử dụng
Sử dụng các thiết bị chủ yếu có trong phòng thí nghiệm Hóa phân tích và Chuyển giao công nghệ của Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang bao gồm: nồi autocla tự chế, máy đo pH HANA của Mỹ, máy Elisa của hãng BioTek Mỹ.
2.5. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU
Phân tích ANOVA và thống kê bằng phần mềm MS. Excell 2010. Loại bỏ giá trị bất thường bằng phương pháp Dulcan. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần.
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. ĐÁNH GIÁ HÀM LƯỢNG POLYPHENOL CÓ TRONG CÁC BỘ PHẬN THÂN, RỄ VÀ RÂU BẮP PHẬN THÂN, RỄ VÀ RÂU BẮP
Tiến hành 3 mẫu thí nghiệm chiết rút polyphenol từ các bộ phận khác nhau của cây bắp: Mẫu 1: chiết rút polyphenol từ thân, Mẫu 2: chiết rút polyphenol từ rễ và Mẫu 3: chiết rút polyphenol từ râu bắp. Các mẫu đều sử dụng cùng một lượng nguyên liệu: 100g. Quá trình chiết rút polyphenol từ các phần của cây bắp được thực hiện ở nhiệt độ phòng và sử dụng dung môi Ethanol 96% để chiết rút trong thời gian 24 giờ với tỷ lệ DM:NL là 20:1 (v/w). Sau khi chiết rút, lọc thu dịch chiết và tiến hành đánh giá hàm lượng polyphenol, hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết thu được. Kết quả đánh giá được trình bày ở các hình 3.1, 3.2 và 3.3.
Hình 3.1. Sự thay đổi hàm lượng polyphenol của dịch chiết thu nhận từ rễ, râu và thân bắp
Hình 3.2. Sự thay đổi hoạt tính chống oxy hóa tổng của dịch chiết thu nhận từ rễ, râu và thân bắp
Hình 3.3. Sự thay đổi hoạt tính khử Fe của dịch chiết thu nhận từ rễ, râu và thân bắp Từ các kết quả phân tích ở các hình 3.1, 3.2 và 3.3 cho thấy:
+ Về hàm lượng polyphenol
Kết quả phân tích cho thấy dịch chiết trong ethanol 96% của các bộ phận khác nhau của cây bắp có chứa hàm lượng polyphenol với hoạt tính chống oxy hóa khác nhau. Trong đó dịch chiết từ thân bắp có hàm lượng polyphenol cao nhất và đạt mức 2,413 (g acid gallic/100g mẫu). Trong khi đó, dịch chiết từ rễ và râu bắp có hàm lượng