Các loại vi sinh vật tìm thấy trong chao bao gồm nấm mốc và vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme protease (để thủy phân protein đậu phụ) và tạo hương. Các loài được tìm thấy: Actinomucor elegans, Micrococus hiemalis, M. Silvaticus, M. Sultilis…trong đó Actinomucor elegans là loài tốt nhất và được sử dụng rộng rãi nhất.
. Tiêu chuẩn đối với một chủng vi sinh vật để sản xuất chao như sau:
Khuẩn ty thể của nấm phải tròn, bóng, có màu trắng hoặc hơi vàng để chao sản xuất có màu đặc trưng.
Cấu trúc nấm sợi phải chặt, dày, tạo một lớp màng vững chắc trên mặt bánh đậu để giứ được hình dạng ban đầu.
Không tạo mùi vị khó chịu do nấm bị nhiễm. Tạo được enzyme có hoạt tính protease cao
Vì thế, muốn chao có chất lượng tốt, sản phẩm ổn định, trong sản xuất phải có vi sinh vật thuần chủng và tạo các điều kiện tối thích như nhiệt độ, độ ẩm, môi trường, pH…
Sản xuất mốc giống: trải qua 3 giai đoạn: sản xuất giống ống thạch, sản xuất giống trung gian và sản xuất giống bào tử.
Sản xuất ống giống thạch: Môi trường có thành phần: agar: 18÷20g, đường 20g, nước giá đậu 1 lít.
Rửa sạch 300g giá đậu cho vào 1lít nước sau đó đun sôi trong khoảng thời gian 30phút rồi chắt lấy nước và bổ sung thêm nước tiến hành định mức cho đủ 1lít. Cho thêm 18÷20g thạch và đun sôi rồi lọc. Điều chỉnh ph = 4,5÷5,0 bằng acid citric hoặc bằng acid acetic. Cân 20g đường bổ sung vào và đun sôi rồi phân phối vào các ống nghiệm để làm thạch nghiêng. Tiến hành cấy nấm mốc bằng que cấy vào trong ống nghiệm và nuôi ở nhiệt độ 28÷300C trong thời gian khoảng 4÷5ngày.
Sản xuất giống trung gian: nuôi trong bình tam giác hoặc nuôi trong hộp nhôm. Môi trường nuôi có các thành phần như sau: bã đậu phụ: 1kg, bột mì: 0,5 kg.
Dùng nước điều chỉnh độ ẩm sao cho đạt 70÷72%, pH của môi trường được điều chỉnh đến 5,5÷6,0 bằng các acid thực phẩm nói trên rồi phân phối vào các bình tam giác từ 50÷60gam, nút bông chặt và hấp thanh trùng trong thời gian 45 phút ở áp suất hơi nước 1,2kg/cm2. Sau đó làm nguội rồi cấy giống từ ống thạch sang. Nuôi ở nhiệt độ 28÷30oC khoảng 18÷24giờ thấy xuất hiện khuẩn ty trắng. Nuôi tiếp 3÷4 ngày ta có giống trung gian.
Đối với trường hợp ta nhân giống trung gian ở các hộp nhôm thì phải dùng các hộp nhôm có đường kính khoảng 30cm, cao 12cm và có nắp đậy kín. Thành phần môi trường tương tự như nuôi trong bình tam giác. Tiến hành nuôi ở độ ẩm 62÷67% nếu hấp trong điều kiện thủ công.
Sản xuất giống bào tử: cho ống giống trung gian vào bột mì đã rang chín để nguội với tỷ lệ 1:1, trộn đều rồi rây lấy bột có bào tử và khuẩn ty, đây chính là hỗn hợp bào tử giống cho sản xuất.