III. MỘT SỐ QUY TRèNH KIỂM NGHIỆM VACXIN TẠI VIỆT NAM
3.2. Quy trỡnh kiểm nghiệm vacxin virus
3.2.1. Quy trỡnh kiểm nghiệm vacxin Newcastle chủng Lasota
Phạm vi áp dụng:
Quy trỡnh này ỏp dụng cho việc kiểm nghiệm vacxin chế tạo từ chủng virus Lasota
(2)
Liều LD50 phải được xỏc định trong từng lụ kiểm nghiệm: lgPD50 = ĐC LD lg MD LD lg 50 50 >= 4
phũng bệnh Newcastle cho gà dưới 2 thỏng tuổi, dạng đụng khụ. . Mẫu: theo 10 TCN 160 - 92
Kiểm tra thuần khiết: theo 10 TCN 161 - 92
Kiểm tra an toàn:
Dựng 20 gà mẫn cảm (2 - 10 ngày tuổi) chia làm 2 tổ:
- Tổ 1: 10 con, mỗi con được uống 10 liều vacxin sử dụng - Tổ2: 10 con làm đối chứng.
Theo dừi trong 10 ngày. Gà ở mỗi tổkhụng được chết quỏ 3 con. Số gà chết bằng nhau hoặc tổ 1 chết ớt hơn và khụng được cú triệu chứng bệnh tớch giống bệnh Newcastle.
Kiểm tra hiệu lực:
Phương phỏp trọng tài:
Gõy miễn dịch cho 10 gà (dưới 2 thỏng tuổi) mỗi con 1 liều vacxin sử dụng. Sau 14 ngày cỏc gà miễn dịch (sau khi đó đư ợc lấy mỏu làm phản ứng HI) cựng với 5 gà đối chứng được thử thỏch với virus Newcastle cường độc, mỗi con 105 - 106 EID50. Theo dừi trong 14 ngày, lụ vacxin đạt tiờu chuẩn nếu: gà đối chứng chết ớt nhất 3 con; gà miễn dịch chết khụng quỏ 2 con. Trường hợp gà chết khụng đỳng, quỏ quy định thỡ hiệu giỏ HI bỡnh quõn của gà miễn dịch phải từ 1/20 trở lờn.
Phương phỏp thay thế:
Chuẩn độhàm lượng virus. Mỗi liều vacxin phải chứa ớt nhất 106 EID50.
3.2.2. Quy trỡnh kiểm nghiệm vacxin Newcastle chủng Hệ I
Phạm vi áp dụng:
Quy trỡnh này ỏp dụng cho việc kiểm nghiệm vacxin chế tạo từ chủng virus Newcastle hệ I phũng bệnh Newcastle cho gà trờn 2 thỏng tuổi, dạng đụng khụ.
. Mẫu: theo 10 TCN 160 - 92
. Kiểm tra thuần khiết: theo 10 TCN 161 - 92
. Kiểm tra an toàn:
Tiờm dưới da cho 3 gà mẫn cảm (trờn 2 thỏng tuổi trọng lượng từ 0,7 kg trở lờn), mỗi con 10 liều vacxin sử dụng. Theo dừi trong 10 ngày, tất cả gà phải sống khoẻ.
. Kiểm tra hiệu lực:
Phương phỏp trọng tài:
Gõy miễn dịch cho 3 gà (tiờu chuẩn như trờn), mỗi con 1 liều vacxin sử dụng. Sau 10 - 14 ngày, cỏc gà miễn dịch cựng với 3 g à đối chứng được thử thỏch với virus cường độc Newcastle, đường dưới da, mỗi con từ 105 - 106 EID50. Theo dừi trong 14 ngày, lụ vacxin đạt tiờu chuẩn nếu: Tất cả cỏc gà miễn dịch đều sống khoẻ, gà đối chứng chết ớt nhất 2 con.
Phương phỏp thay thế:
Chuẩn độhàm lượng virus. Mỗi liều vacxin phải chứa ớt nhất 106 EID50.
3.2.3. Quy trỡnh kiểm nghiệm vacxin Newcastle chủng F
Phạm vi áp dụng:
Quy trỡnh này ỏp dụng cho việc kiểm nghiệm vacxin chế tạo từ chủng F phũng bệnh Newcastle cho gà, dạng đụng khụ.
. Mẫu: theo 10 TCN 160 - 92
. Kiểm tra thuần khiết: theo 10 TCN 161 - 92
. Kiểm tra an toàn:
- Tổ 1: 10 con, mỗi con được nhỏ mắt 10 liều vacxin sử dụng - Tổ2: 10 con làm đối chứng.
Theo dừi trong 10 ngày, gà ở mỗi tổkhụng được chết quỏ 3 con. Số gà chết bằng nhau hoặc tổ 1 chết ớt hơn và khụng được cú triệu chứng bệnh tớch giống bệnh Newcastle.
. Kiểm tra hiệu lực:
Phương phỏp trọng tài:
Gõy miễn dịch cho 10 gà (10 - 15 ngày tuổi) mỗi con 1 liều vacxin sử dụng. Sau 14 ngày, cỏc gà miễn dịch cựng với 5 gà đối chứng được thử thỏch với virus Newcastle cường độc mỗi con 100 LD50. Theo dừi 10 ngày, lụ vacxin đ ạt tiờu chuẩn nếu: gà đối chứng chết ớt nhất 4 con, gà miễn dịch chết khụng quỏ 2 con.
Phương phỏp thay thế: Chuẩn độhàm lượng virus. Mỗi liều vacxin phải chứa ớt nhất 106 EID50.
3.2.4. Quy trỡnh kiểm nghiệm vacxin Gumboro nhược độc
Phạm vi áp dụng:
Quy trỡnh này ỏp dụng cho việc kiểm nghiệm vacxin chế tạo từ phụi gà hoặc tếbào đó được gõy nhiễm bằng một chủng virus Gumboro (Infections Bursa Disease Virus - IBDV) nhược độc hoặc vụ độc tự nhiờn. Vacxin dạng đụng khụ.
. Mẫu: theo 10 TCN 160 - 92
. Kiểm tra thuần khiết: theo 10 TCN 161 - 92
Kiểm tra tạp nhiễm virus Newcastle bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu. . Kiểm tra an toàn:
Phương phỏp trọng tài:
Nhỏ mắt hoặc uống cho 15 gà mẫn cảm (1ngày tuổi) mỗi con 10 liều vacxin sử dụng. 15 gà khỏc cựng nguồn gốc và lứa tuổi được nuụi cỏch ly nghiờm ngặt làm đối chứng. Sau 3 tuần theo dừi đỏnh giỏ bằng 1 trong 2 cỏch sau:
- Xột nghiệm bệnh lý tổ chức tuyến tỳi Fabricius. Tất cảgà đều khụng được cú dấu hiệu bệnh lý của IBD ở tỳi Fabricius
- So sỏnh tỷ lệ giữa trọng lượng của tỳi và thể trọng của gà ở cả hai lụ dựng vacxin và đối chứng. Tỷ lệ giữa trọng lượng của tỳi và thể trọng của gà giữa hai lụ khụng được cú sai khỏc đỏng kể (P < 0,01).
Phương phỏp thay thế:
Nhỏ mắt cho 10 gà 1 ngày tuổi (hoặc cho uống), mỗi con 10 liều vacxin sử dụng, 10 gà khỏc cựng nguồn gốc và lứa tuổi được nuụi cỏch ly nghiờm ngặt làm đối chứng. Sau 14 ngày cả 2 lụ gà được miễn dịch bằng vacxin Newcastle chủng Lasota hoặc chủng F, mỗi con một liều qui định. Theo dừi tiếp trong 10 - 14 ngày. Toàn bộgà được lấy mỏu kiểm tra hiệu giỏ khỏng thể khỏng Newcastle bằng phản ứng ngăn cản ngưng kết hồng cầu (HI). Hiệu giỏ HI giữa 2 lụ gà khụng được cú sự khỏc biệt đỏng kể (khụng quỏ 30% mẫu mỏu của lụ miễn dịch thấp hơn lụ đối chứng).
Kiểm tra hiệu lực:
Phương phỏp trọng tài:
Miễn dịch cho 20 gà (1 tuần tuổi) mỗi con 1 liều vacxin quy định. Sau 10 - 14 ngày, gà miễn dịch cựng với 20 gà đối chứng được thử thỏch với virus cường độc IBD tương ứng với liều 102 TCID50. Theo dừi trong 10 ngày. Vacxin đư ợc xem là đạt tiờu chuẩn hiệu lực khi ớt nhất 50% gà đối chứng chết hoặc cú triệu chứng của IBD, sốđối chứng cũn lại phải cú dấu hiệu bệnh lý tổ chức nặng ở tỳi Fabricius, cũn đối với gà được miễn dịch thỡ yờu cầu gà khoẻ
mạnh đạt từ 70% trởlờn sau khi cụng cường độc được 10 ngày. Phương phỏp thay thế:
Chuẩn độhàm lượng virus cú trong vacxin. Mỗi liều vacxin phải cú khụng ớt hơn 103
TCID50. Xỏc định hiệu giỏ khỏng thể trung hoà. Khụng ớt hơn 10 mẫu mỏu gà đó đư ợc miễn dịch như quy định, được kiểm tra bằng phản ứng trung hoà với liều virus cố định 102 TCID50. Huyết thanh phản ứng phải đạt hiệu giỏ ớt nhất 1/256.
3.2.5. Quy trỡnh kiểm nghiệm vacxin đậu gà
Phạm vi áp dụng:
Quy trỡnh này ỏp dụng cho việc kiểm nghiệm vacxin chế tạo từ một chủng virus đậu nhược độc thớch hợp (đậu gà, đậu gà tõy, đậu bồ cõu) trờn phụi gà hoặc tế bào. Vacxin dạng đụng khụ.
. Mẫu: theo 10 TCN 160 - 92
. Kiểm tra thuần khiết: theo 10 TCN 161 - 92
. Kiểm tra an toàn: Chủng vacxin vào dưới da cho 10 gà (1 - 2 tuần tuổi) mỗi con 10 liều quy định. Theo dừi trong 14 ngày, tất cả gà phải sống khoẻ.
Phương phỏp trọng tài:
Miễn dịch cho 10 gà (2 - 6 tuần tuổi) mỗi con 1 liều vacxin sử dụng. Sau 3 tuần tuổi gà miễn dịch cựng với 5 gà đối chứng được thử thỏch với chủng virus đậu cường độc. Theo dừi trong 10 ngày, tất cả gà đối chứng phải cú bệnh tớch mụn đậu trong khi gà miễn dịch khụng cú.
Phương phỏp thay thế:
Miễn dịch cho 10 gà (3 - 10 ngày tuổi) mỗi con 1 liều sử dụng bằng cỏch chủng vào dưới da. Theo dừi trong 10 ngày, vacxin đư ợc xem là đạt tiờu chuẩn hiệu khi cú khụng ớt hơn 8 gà cú mụn đậu ởnơi chủng trong khoảng 3 - 5 ngày.
Chuẩn độ hàm lượng virus cú trong vacxin, mỗi liều vacxin phải chứa khụng ớt hơn 102 EID50.
3.2.6. Quy trỡnh kiểm nghiệm vacxin vụ hoạt Egg Drop syndrome
Phạm vi áp dụng:
Quy trỡnh này ỏp dụng cho việc kiểm nghiệm vacxin vụ hoạt chế từ chủng virus Egg Drop Syndrome 76 (EDS), phũng bệnh hội chứng giảm đẻở gà.
. Mẫu: theo 10 TCN 160 - 92 "Vacxin thỳ y - Quy trỡnh lấy mẫu và sử dụng mẫu trong kiểm nghiệm".
. Kiểm tra vụ trựng: theo 10 TCN 161 - 92 "Vacxin thỳ y - Quy trỡnh kiểm tra vụ trựng". Kiểm tra vụ hoạt:
Ít nhất 10 phụi thai vịt 11 - 12 ngày tuổi, mẫn cảm với virus EDS, mỗi phụi được tiờm 0,2ml vacxin vào xoang niệu. Trứng được ấp tiếp 3 - 7 ngày. Mổ thu hoạch nước trứng, kiểm tra virus bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu gà (HA), cú thể tiến hành kiểm tra virus trờn tế bào gan phụi hoặc tếbào xơ phụi thai vịt.
Kết quảđạt nếu khụng cú dấu hiệu của virus EDS. Kiểm tra an toàn:
20 gà khỏe mạnh 4 - 6 tuần tuổi, mỗi con 2 liều vacxin sử dụng, tiờm bắp. Theo dừi 14 ngày, tất cả gà phải sống khỏe.
Kiểm tra hiệu lực:
Sau 3 tuần gà đó đư ợc miễn dịch cựng 5 gà đối chứng (khụng tiờm vacxin) được lấy mỏu kiểm tra huyết thanh bằng phương phỏp ngăn trởngưng kết hồng cầu (HI) hoặc bằng phương phỏp ELISA.
- Khỏng nguyờn dựng trong phản ứng HI là chủng virus EDS 76 đạt 4 đơn vị HA. - Huyết thanh bắt đầu với độ pha loóng 1 : 4
- Hồng cầu gà 0,8%.
Chủng virus EDS 76 cú khả năng ngưng kết hồng cầu gà, gà tõy, ngan và vịt khụng ngưng kết hồng cầu của động vật cú vỳ.
Vacxin đạt tiờu chuẩn nếu:
Hiệu giỏ HI lớn hơn hoặc bằng 8log2và gà đối chứng phải cú phản ứng õm tớnh.
3.2.7. Quy trỡnh kiểm nghiệm vacxin Viờm gan siờu vi trựng vịt
Phạm vi áp dụng:
Quy trỡnh này ỏp dụng cho việc kiểm nghiệm vacxin chế từ chủng virus viờm gan vịt nhược độc, phũng bệnh viờm gan vịt và ngan dưới 6 tuần tuổi.
Mẫu: theo 10 TCN 160 - 92 "Vacxin thỳ y - Quy trỡnh lấy mẫu và sử dụng mẫu trong kiểm nghiệm".
Kiểm tra thuần khiết:theo 10 TCN 161 - 92 "Vacxin thỳ y - Quy trỡnh kiểm tra thuần khiết".
Kiểm tra an toàn:
Tiờm dưới da hoặc bắp thịt cho 20 vịt con 1 - 3 ngày tuổi, mỗi con được tiờm 10 liều vacxin quy định. Theo dừi 14 ngày, tất cả vịt phải sống khỏe.
. Kiểm tra hiệu lực:
Sử dụng một trong 2 phương phỏp sau: Phương phỏp trọng tài:
Tiờm miễn dịch cho 20 vịt con 1 - 3 ngày tuổi (tiờm dưới da). Sau 72 giờ, cỏc vịt miễn dịch cựng với 20 vịt đối chứng được thử thỏch với virus viờm gan vịt cường độc liều 103,0LD50(tiờm dưới da). Theo dừi 10 ngày, lụ vacxin đạt tiờu chuẩn nếu ớt nhất 70% vịt được tiờm vacxin sống và ớt nhất 70% vịt đối chứng chết.
Phương phỏp thay thế:
Chuẩn độ hàm lượng virus vacxin bằng phương phỏp tiờm tỳi niệu phụi gà 8 - 10 ngày. Tiờm tỳi niệu nang. Mỗi liều vacxin phải chứa ớt nhất 103,3ELD50.(2F
3)
3.2.8. Quy trỡnh kiểm nghiệm vacxin dịch tả vịt nhược độc
Phạm vi áp dụng:
Quy trỡnh này ỏp dụng cho việc kiểm nghiệm vacxin chế từ chủng virus dịch tả vịt nhược độc qua phụi vịt, dạng đụng khụ.
Mẫu: theo 10 TCN 160 - 92
Kiểm tra thuần khiết:
- theo 10 TCN 161 - 92
- Kiểm tra tạp nhiễm virus viờm gan vịt
Tiờm vào dưới da cho 5 vịt mới nở, mỗi con 10 liều vacxin sử dụng. Theo dừi trong 14
(3)
ELD50: Embryo Lethal Dose 50% - Liều gõy chết 50 % phụi thớ nghiệm MLD: Minimum Lethal Dose - Liều nhỏ nhất gõy chết hết động vật thớ nghiệm.
ngày, tất cả vịt phải sống khoẻ mạnh. . Kiểm tra an toàn:
Phương phỏp trọng tài:
Tiờm dưới da cho 3 vịt mẫn cảm (0,7 - 1 kg) mỗi con 50 liều vacxin sử dụng. Theo dừi 14 ngày, tất cả vịt đều phải sống khoẻ mạnh.
Phương phỏp thay thế: như phần 3.2.7. . Kiểm tra hiệu lực:
Tiờm miễn dịch cho 3 vịt (0,7 - 1 kg), mỗi con một liều vacxin sử dụng. Sau 14 ngày, cỏc vịt miễn dịch cựng với 3 vịt đối chứng được thử thỏch với virus dịch tả vịt cường độc với liều 103 EID50 (tương đương 1ml giống nguyờn pha loóng 10 - 2). Theo dừi 14 ngày, lụ vacxin đạt tiờu chuẩn nếu: Vịt đối chứng chết hết, vịt miễn dịch sống toàn bộ.
3.2.9. Quy trỡnh kiểm nghiệm vacxin dại cốđịnh
Phạm vi áp dụng:
Quy trỡnh này ỏp dụng cho việc kiểm nghiệm vacxin chế tạo từ nóo bờ đó được gõy nhiễm virus dại cốđịnh và vụ hoạt bằng phương phỏp thớch hợp. Vacxin cú dạng lỏng hoặc đụng khụ. . Mẫu: theo 10 TCN 160 - 92
. Kiểm tra thuần khiết: theo 10 TCN 161 - 92
. Kiểm tra an toàn:
Phương phỏp trọng tài:
Tiờm cho 2 chú mẫn cảm (3 thỏng tuổi) mỗi con 2 liều vacxin sử dụng theo phương phỏp qui định. Theo dừi trong 10 ngày, cả hai chú phải sống khoẻ.
Phương phỏp thay thế:
Tiờm vào dưới da hay xoang bụng cho 3 chuột nhắt trắng (18 - 20g) mỗi con 1/10 liều vacxin sử dụng và 2 chuột lang (250 - 350g) mỗi con 1 liều sử dụng. Theo dừi trong 10 ngày tất cảđộng vật phải sống khoẻ.
. Kiểm tra hiệu lực:
Phương phỏp trọng tài:
Gõy miễn dịch cho 60 chuột nhắt trắng (15 - 16g) bằng cỏch tiờm xoang bụng, trong 2 tuần liền, mỗi tuần 3 lần, mỗi lần 0,25 ml vacxin cho một chuột (tổng số 6 lần). 30 chuột cựng nguồn gốc và lứa tuổi được giữlàm đối chứng, khụng tiờm vacxin.
Sau 14 ngày kể từ lần tiờm thứ nhất, chuột miễn dịch được thử thỏch với virus dại cường độc CVS (Challenge virus Standara) theo 5 nhúm, mỗi nhúm 10 con với liều 10 - 1, 10 - 2,… và 10 - 5 . Đồng thời đối chứng cũng được tiờm cường độc theo 3 nhúm mỗi nhúm 10 con, liều 10 - 5, 10 - 6 và 10 - 7, đường tiờm nóo (intracerebrally), l ợưng tiờm 0,03ml. Theo dừi trong 14 ngày, chỉ tớnh những chuột chết và bại liệt từ ngày thứ 5 trởđi, LD50 của 2 lụ chuột đối chứng và miễn dịch phải khỏc nhau ớt nhất 3 log thỡ vacxin được xem là đạt tiờu chuẩn hiệu lực.
Phương phỏp thay thế:
Dựng 8 chuột lang (250 - 300g) chia làm 4 nhúm mỗi nhúm 2 con. Chuột được tiờm vacxin vào nóo theo sơ đồ sau:
Nhúm 1: Liều tiờm bằng 1/150 liều sử dụng, vacxin pha 1/50 Nhúm 2: Liều tiờm bằng 1/1500 liều sử dụng, vacxin pha 1/500 Nhúm 3: Liều tiờm bằng 1/15000 liều sử dụng, vacxin pha 1/5000 Nhúm 4: Liều tiờm bằng 1/150.000 liều sử dụng, vacxin pha 1/50.000 Theo dừi trong 14 ngày, vacxin đạt tiờu chuẩn hiệu lực nếu:
Nhúm 1: Chuột chết hết.
Nhúm 4: Chuột sống cả 2 con
3.2.10. Quy trỡnh kiểm nghiệm vacxin dại Flury - Lep
Phạm vi áp dụng:
Quy trỡnh này ỏp dụng cho việc kiểm nghiệm vacxin chế từ virus dại nhược độc Flury - Lep qua phụi gà. Vacxin cú dạng lỏng hoặc đụng khụ.
. Mẫu: theo 10 TCN 160 - 92
. Kiểm tra thuần khiết: theo 10 TCN 161 - 92
. Kiểm tra an toàn:
Phương phỏp trọng tài:
Tiờm cho 3 chú mẫn cảm (3 - 4 thỏng tuổi) mỗi con 1 liều vacxin sử dụng. Theo dừi trong 21 ngày, cả hai chú phải sống khoẻ.
Phương phỏp thay thế:
Tiờm vào dưới da hay xoang bụng cho 8 chuột nhắt trắng (16 - 18g) mỗi con 1/4 liều vacxin sử dụng. Theo dừi trong 7 ngày ớt nhất phải cú 7 chuột sống khoẻ.
. Kiểm tra hiệu lực: Dựng 1 trong 2 phương phỏp sau: Kiểm tra hiệu lực bằng chuột lang:
Tiờm bắp cho 10 chuột lang (300 - 350g), mỗi con 1/80 liều sử dụng (vacxin đó đư ợc pha loóng thành huyễn dịch 5% với nước sinh lý và cú 2% huyết thanh ngựa).
Sau 21 ngày cỏc chuột đó gõy miễn dịch cựng với 5 chuột đối chứng được thử thỏch với virus dại cường độc, chủng CVS, mỗi con 1/2 liều gõy chết 100% chuột lang.
Theo dừi trong 14 ngày, lụ vacxin đạt tiờu chuẩn nếu: Chuột miễn dịch sống 70%, chuột