II PHẢNỨNG HUYẾT THANH HỌC
2. Cỏc phảnứng huyết thanh học cú thể quan sỏt trực tiếp
2.1. Phản ứng ngưng kết (Agglutination Test)
Là phản ứng liên kết các tiểu thể có kích thước nhỏ tính bằng Micromet thành một cấu trúc lớn quan sát được bằng mắt thường.
ởđây kháng nguyên là một cấu phần nằm trên bề mặt tiểu thể.
hiệu, các vi khuẩn sẽ kết lại với nhau thành đám lớn, mắt thường có thể quan sát được.
Sự ngưng kết kháng nguyên - kháng thể dưới hình thức mạng lưới nhiều chiều, tạo nên đám ngưng kết, biểu hiện của nó bằng những đám lấm tấm hoặc lổn nhổn như những hạt cát.
Hình 6.1.Mô phỏng mạng lưới ngưng kết giữa kháng nguyên và kháng thể
Với lớp kháng thể IgM, phản ứng ngưng kết dễ xảy ra hơn vì nó có 10 vị trí kết hợp với kháng nguyên, IgG chỉ có 2 vị trí.
2.1.2. Các loại phản ứng ngưng kết
Phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính
Đây là phản ứng có tính chất định tính. Thường sử dụng kháng nguyên đã biết được nhuộm màu để phát hiện kháng thể tương ứng trong huyết thanh. Thường dùng để chẩn đoán bệnh truyền nhiễm như: bệnh thương hàn gà (Typhus avium), CRD (Chronic respiratory disease), liên cầu khuẩn, đóng dấu lợn,sảy thai truyền nhiễm…
* Cách làm:
Dùng một phiến kínhchia hai phần: một bên thí nghiệm, một bên đối chứng.
Bên thí nghiệm nhỏ một giọt huyết thanh cần chẩn đoán, bên đối chứng nhỏ 1 giọt nước sinh lý, sau đó mỗi bên nhỏ 1 giọt kháng nguyên đã biết, rồi trộn đều, 1 - 2 phút sau đọc kết quả:
Phản ứng dương tính: kháng nguyên bị ngưng kết thành từng đám lấm tấm trên phiến kính, mắt thường nhìn thấy được.
Phản ứng âm tính: không có hiện tượng ngưng kết, kháng nguyên hòa đều trong hỗn dịch giống như bên đối chứng.
Phản ứng (+) Phản ứng ( - )
Hình.6.2. Phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính.
* Ứng dụng:
Phản ứng ngưng kết nhanh trờn phiến kớnh để chẩn đoỏn bệnh đúng dấu lợn
U
Cỏc bước tiến hành:
- Chuẩn bị khỏng nguyờn: Khỏng nguyờn đó bi ết là vi khuẩn E. rhusiopathiae nuụi trong 24 - 48h, đõy là khỏng nguyờn sống.
- Chuẩn bị huyết thanh nghi: Lấy mỏu lợn nghi mắc bệnh chắt lấy huyết thanh, pha loóng thành 4 nồng độ khỏc nhau với nước sinh lý: huyết thanh nguyờn, 1/4, 1/8, 1/16.
Cỏch làm: Dựng phiến kớnh chuyờn dụng cú 5 lỗ lừm và 5 la men để ỳp vào 5 lỗđú. Nhỏ lờn 4 lamen mỗi lamen một giọt huyết thanh ở cỏc nồng độ pha loóng như trờn, lamen thứ 5 nhỏ một giọt nước sinh lý làm đối chứng õm ( - ).
ỏ ọ ế ở ỗ ọ ố ộn đề
Kháng thể
vaselin lờn bờ cỏc lỗ lừm rồi lật ỳp cỏc lamen vào cỏc lỗ lừm. Để tủ ấm 370C/15 phỳt, lấy ra đọc kết quả trờn kớnh hiển vi với vật kớnh cú số bội giỏc thấp.
U
Kết quả:
- Phản ứng dương tớnh: vi khuẩn bịngưng kết thành từng đỏm, xung quanh trong. Lợn mắc bệnh.
- Phản ứng õm tớnh: vi khuẩn phõn tỏn đều giống đối chứng. Lợn khụng mắc bệnh. Phản ứng ngưng kết nhanh với mỏu để chẩn đoỏn bệnh đúng dấu lợn
U
* Chuẩn bị:
- Chế khỏng nguyờn: Nuụi cấy vào mụi trường trực khuẩn đúng dấu lợn chủng tiờu chuẩn, sau 24h đem ly tõm lấy cặn, pha thành nồng độ cú 15 tỷ vi khuẩn/ml với nước sinh lý cú 1% focmol. Để tủ lạnh 40C thời gian 1 tuần, hỳt bỏ 20% nước trong, bổ sung 20% glyxerin rồi nhuộm vi khuẩn bằng tớm gentian bóo hoà (98ml nư ớc và 2g tớm gentian), cứ 10ml huyễn dịch vi khuẩn cú glycerin thỡ cho thờm 0,2ml dung dịch tớm gentian.
- Lấy mỏu lợn nghi bệnh: Lấy mỏu ở tĩnh mạch tai, khi cần vận chuyển đi xa cho thờm xitrat natri 5% để chống đụng.
U
* Tiến hành phản ứng:
Dùng một phiến kính chia hai phần: một bên thí nghiệm, một bên đối chứng.
Bên thí nghiệm nhỏ một giọt huyết thanh cần chẩn đoán, bên đối chứng nhỏ 1 giọt nước sinh lý, sau đó mỗi bên nhỏ 1 giọt kháng nguyên đã biết, rồi trộn đều, 1 - 2 phút sau đọc kết quả:
Phản ứng dương tính: kháng nguyên bị ngưng kết thành từng đám lấm tấm trên phiến kính, mắt thường nhìn thấy được.
Phản ứng âm tính: không có hiện tượng ngưng kết, kháng nguyên hòa đều trong hỗn dịch giống như bên đối chứng.
U
* Kết quả:
- Phản ứng dương tớnh: vi khuẩn bị ngưng kết thành từng đỏm màu tớm, nước xung quanh trong. Lợn mắc bệnh.
- Phản ứng õm tớnh: hỗn dịch cú màu tớm, vi khuẩn phõn tỏn đều giống như bờn đối chứng. Lợn khụng mắc bệnh.
Phản ứng ngưng kết nhanh trờn phiến kớnh (phản ứng Huddleson) chẩn đoỏn bệnh sảy thai truyền nhiễm
+ Chuẩn bị khỏng nguyờn tiờu chuẩn - khỏng nguyờn Huddleson: Dựng vi khuẩn brucella tiờu chuẩn cấy vào mụi trường thạch cú glyxerin và đường glucoza, nuụi ở 370C/48h. Dựng nước muối 12% để rửa mặt thạch, sau đú cho axit fenic giết vi khuẩn và cho tớm gentian để nhuộm màu khỏng nguyờn, hỗn dịch khỏng nguyờn cú màu tớm.
+ Chuẩn bị khỏng thể: Lấy mỏu gia sỳc nghi bệnh chắt lấy huyết thanh. Pha loóng huyết thanh ở nồng độ 1/50 sau đú pha loóng huy ết thanh theo cỏc hiệu giỏ khỏc nhau 1/100,1/200,1/400…, huyết thanh phải tươi, trong, khụng lẫn mỏu.
+ Tiến hành phản ứng :
- Dựng tấm kớnh sạch cú kớch thước 30 x 25cm. Dựng bỳt viết kớnh chia chiều ngang làm 4 phần chiều dọc làm 6 phần được 24 ụ. Cú thể làm phản ứng với 4 mẫu huyết thanh khỏc nhau trờn một tấm kớnh.
Nguyên liệu 1 2 3 4 Đ/C HT Đ/C KN OO OO OO OO OO OO Huyết thanh nghi (àl) 50 50 50 50 50
Hiệu giá huyết thanh 1/50 1/100 1/200 1/400
Kháng nguyên (àl) 50 50 50 50 50
- Nhỏ khỏng nguyờn chuẩn lờn tấm kớnh, sau đú nhỏ huyết thanh sỏt vào bờn cạnh khỏng nguyờn, dựng đũa thuỷ tinh vụ trựng trộn đều khỏng nguyờn với huyết thanh (trộn từ phải sang trỏi). Hơ qua tấm kớnh trờn ngọn lửa đốn cồn (370C), trong vũng 1 - 2 phỳt.
- Đọc kết quả: Dựa vào mức độngưng kết và sự mất màu của hỗn dịch.
Ngưng kết ++++: Hỗn dịch mất màu hoàn toàn, cỏc cụm ngưng kết lớn màu xanh tớm. Ngưng kết +++: Hỗn dịch mất màu, nhiều cụm ngưng kết nhỏ màu xanh tớm.
Ngưng kết ++: Hỗn dịch nhạt màu, một số cụm ngưng kết nhỏ màu xanh tớm. Ngưng kết +: Hỗn dịch mất màu khụng rừ.
+ Đỏnh giỏ phản ứng: Nếu cú ngưng kết ở mức ++ và độ pha loóng từ1/100 đến 1/200 trở lờn thỡ phản ứng được coi dương tớnh. Con vật mắc bệnh.
Phản ứng ngưng kết chậm trong ống nghiệm để chẩn đoán bệnh sảy thai truyền nhiễm
Phản ứng vừa có tính chất định tính, vừa có thể định lượng kháng thể Cách làm:
Dùng một dãy ống nghiệm, cho vào ống thứ nhất một lượng huyết thanh, rồi pha loãng huyết thanh theo cơ số 2 (1/2; 1/4; 1/8...). Sau đó cho vào mỗi ống nghiệm một lượng kháng nguyên (lượng kháng nguyên tương đương với lượng kháng thể). Trộn đều để ở nhiệt độ thích hợp (tủ ấm 370C) sau 30 phút hoặc vài giờ, đọc kết quả và tính được hiệu giá ngưng kết.
Hiệu giá ngưng kết: Là độ pha loãng cao nhất của huyết thanh mà ở đó vẫn còn khả năng gây hiện tượng ngưng kết
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Nước sinh lý (ml) 0,8 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Huyết thanh (ml) 0,2
Hiệu giá huyết thanh 1/5 1/10 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 1/1280
Khỏng nguyờn (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Hình 6.3: Dãy ống nghiệm thử phản ứng ngưng kết
Phản ứng ngưng kết chậm trong ống nghiệm:
Hay cũn gọi là phản ứng Vrait (Wright). Phản ứng này cú tớnh chất định lượng + Chuẩn bị:
- Khỏng nguyờn Vrait: Vi khuẩn Brucella trong nước sinh lý cú focmon ở nồng độđặc 10 tỷ vi khuẩn trong 1ml. Trước khi dựng để chẩn đoỏn pha loóng 1/10 với nước sinh lý, như vậy sẽ cú 1 tỷ vi khuẩn trong 1ml.
- Khỏng thể: Huyết thanh của gia sỳc nghi mắc bệnh, huyết thanh phải tươi, trong, khụng lẫn mỏu. Tiến hành phản ứng theo sơ đồ sau:
1 2 3 4 5 6 7 8 ĐC HT ĐC KN
Nước sinh lý (ml) 0,92 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,92 0,5
Huyết thanh (ml) 0,08 0.08
Hiệu giá huyết thanh 1/12,5 1/25 1/50 1/100 1/200 1/400 1/800 1/1600
Khỏng nguyờn (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5ml hút bỏ 0,5 ml Đ/C 0,5 ml hút bỏ 0,5 ml Đ/C Đ/C
Pha loóng huyết thanh từống 1 - 8 để cú hiệu giỏ từ 1/12,5 - 1/1600. Sau đú cho vào mỗi ống 0,5ml hỗn dịch khỏng nguyờn 1/10, cú bố trớ ống đối chứng. Khối lượng sau cựng trong mỗi ống là 1ml.
Lắc mạnh cỏc ống nghiệm trong 1 phỳt, để cỏc ống nghiệm vào tủấm 370C/24h, lấy ra đểở nhiệt độ phũng thớ nghiệm trong 1 giờvà đọc kết quả, dựa vào độngưng kết và độ trong của mỗi ống nghiệm người ta quy định cỏc mức độngưng kết sau.
- Ngưng kết ++++: Nước nổi bờn trờn trong hoàn toàn, lắng cặn nhiều, hiện tượng ngưng kết giống như cỏi dự lộn ngược.
- Ngưng kết +++: Nước nổi bờn trờn gần trong hoàn toàn, lắng cặn nhiều.
- Ngưng kết ++: Nước nổi bờn trờn khụng trong, trong nước cú những hạt vẩn, lắng cặn ở đỏy ống.
- Ngưng kết +: Nước nổi khụng trong, trong nước cú nhiều hạt lơ lửng, khụng cú lắng cặn ởđỏy.
- Khụng cú hiện tượng ngưng kết: Hỗn dịch vẩn đục đều.
Nếu cú độngưng kết (++) ởđộ pha loóng huyết thanh từ 1/200 - 1/400 thỡ phản ứng được coi là dương tớnh, con vật mắc bệnh.
Ứng dụng phản ứng ngưng kết chẩn đoỏn bệnh do Leptospira gõy ra
Phản ứng vi ngưng kết tan với khỏng nguyờn sống trờn phiến kớnh
+ Nguyờn lý của phản ứng:
Khi trộn huyết thanh của gia sỳc nghi mắc Leptospirosis với hỗn dịch canh khuẩn
Leptospira (gồm nhiều chủng khỏc nhau), nếu trong huyết thanh cú ớt khỏng thể thỡ
Leptospira sẽ ngưng kết chụm lại như hỡnh sao hay hỡnh mạng nhện, hay cụm nhỏ. Nếu trong huyết thanh cú nhiều khỏng thể thỡ Leptospira mới đầu bị ngưng kết, sau đú tan ra thành từng mảnh nhỏ, nờn phản ứng này gọi là phản ứng ngưng kết tan với khỏng nguyờn sống trờn phiến kớnh.
Phản ứng này dựng khỏng nguyờn là 12 chủng Leptospira sống, thực hiện phản ứng trờn phiến kớnh rồi đọc kết quả phản ứng dưới kớnh hiển vi cú tụ quang nền đen.
+ Chuẩn bị
- Khỏng thể nghi: Lấy mỏu của gia sỳc nghi mắc bệnh khoảng 2ml để đụng, chắt lấy huyết thanh, pha loóng huyết thanh với nước sinh lý thành nồng độ 1/200 (nờn lấy mỏu từ ngày thứ 5 sau khi con vật ốm trởđi).
- Khỏng nguyờn: Là canh khuẩn non của 12 chủng Leptospira, cỏc xoắn khuẩn này phải khoẻ, hỡnh thỏi rừ, cú từ 150 - 300 xoắn khuẩn trờn một vi trường.
Thường dựng 12 chủng Leptospira được xếp theo thứ tự A, B, C như sau: L. autralis, L. autumnalis, L. botaviae, L. canicola, L.grippotyphosa, L. hebdomadis, L. icterohemorrhagiae, L. mitis, L. poi, L. pomona, L. saxkoebing, L. sejroe.
Mỗi chủng Leptospira này được nuụi cấy riờng trong mụi trường Terskich hay EMJH, khỏng nguyờn được giữở nhiệt độ 200C, sau 7 - 15 ngày phải cấy chuyển sang mụi trường Terskich mới hoặc EMJH mới và sau 3 thỏng phải tiếp đời qua chuột lang một lần. + Tiến hành phản ứng:
- Mỗi mẫu huyết thanh dựng 3 phiến kớnh, mỗi phiến kớnh chia làm 4 ụ, tất cả được 12 ụ cho 12 chủng. Cú thể tiến hành chẩn đoỏn nhiều mẫu huyết thanh cựng một lỳc, mỗi mẫu huyết thanh 3 phiến kớnh, ghi thứ tự phiến kớnh 1, 2, 3 ở gúc dưới phiến kớnh về phớa bờn phải, cũn gúc trờn về phớa bờn trỏi thỡ ghi số mẫu huyết thanh cần chẩn đoỏn. - Nhỏ lờn mỗi ụ một giọt huyết thanh đó đư ợc pha loóng, rồi lần lượt cho vào mỗi ụ một giọt canh khuẩn của chủng Leptospira. Dựng đũa thu ỷ tinh vụ trựng trộn đều, để ở nhiệt độ phũng 15 - 20 phỳt, đọc kết quả trờn kớnh hiển vi cú tụ quang nền đen.
- Để đỏnh giỏ kết quả người ta dựng kớ hiệu L (Lyse) chỉ hiện tượng tan xoắn khuẩn. L+ vừa cú ngưng kết vừa cú tan xoắn khuẩn.
- L++++: Ngưng kết xảy ra mạnh, cú 30 cụm ngưng kết hỡnh con nhện khụng cú xoắn khuẩn tự do.
- L+++: Ngưng kết vừa, cú 20 - 30 cụm ngưng kết hỡnh con nhện, cú ớt xoắn khuẩn tự do
- L++: Ngưng kết yếu, cú từ 6 - 12 cụm ngưng kết, cú nhiều xoắn khuẩn tự do.
- L+: Ngưng kết rất yếu, cú từ 3 - 5 cụm ngưng kết, cú nhiều xoắn khuẩn tự do. - L - : Khụng cú ngưng kết, từng con bơi rời rạc.
Khi làm phản ứng, nếu cú ụ nào cú ngưng kết ở mức L+++ trở lờn thỡ đư ợc coi ở đú cú chủng Leptospira gõy ra bệnh.
- Do đặc điểm của Leptospra cú khỏng nguyờn chung dễ gõy hiện tương ngưng kết chộo giữ cỏc chủng, mặt khỏc Leptospira gõy bệnh bao giờ cũng cho hiệu giỏ khỏng thể cao hơn cỏc chủng Leptospira khỏc. Vỡ vậy muốn xỏc định chủng gõy bệnh phải pha loóng huyết thanh cao hơn nữa: 1/400, 1/800, 1/1600, 1/3200 rồi làm lại phản ứng ngưng kết với chủng Leptospira ở trờn.
- Đối với bũ, lợn, chú cú hiệu giỏ khỏng thể từ 1/400 thỡ chủng Leptospira đú được coi là chủng gõy bệnh, hiệu giỏ khỏng thể 1/200 là nghi ngờ
- Đối với ngựa cú hiệu giỏ khỏng thể từ 1/800 thỡ chủng Leptospira đú được coi là chủng gõy bệnh, hiệu giỏ khỏng thể 1/400 là nghi ngờ
- Nếu nghi ngờ, sau 7 - 10 ngày lấy mỏu lần 2 để làm phản ứng. * Ưu điểm của phản ứng: Phản ứng nhanh, độ chớnh xỏc cao.
Nhược điểm: - Nguy hiểm cho người làm thớ nghiệm do phải sử dụng vi khuẩn sống - Phải nuụi cấy và tiếp đời vi khuẩn. Khú thực hiện ởđịa phương.
Phản ứng ngưng kết với khỏng nguyờn chết trờn phiến kớnh
- Ưu điểm: An toàn cho người làm, khỏng nguyờn bảo quản được lõu và vận chuyển đi xa được, nờn cú thể ỏp dụng được ởcỏc địa phương.
- Nhược điểm: Độ chớnh xỏc khụng cao. + Chuẩn bị:
- Khỏng thể nghi: Lấy mỏu của gia sỳc nghi mắc bệnh, đểđụng chắt lấy huyết thanh, pha loóng huyết thanh với nước sinh lý thành nồng độ 1/2, 1/4, 1/8, 1/16…
- Khỏng nguyờn chuẩn: Là 12 chủng Leptospira, cỏc chủng này được nuụi riờng trong mụi trường Terskich hoặc EMJH ở nhiệt độ 28 - 300C trong 7 - 10 ngày.
- Kiểm tra vi khuẩn nếu đạt tiờu chuẩn: thuần khiết, mọc dầy, di động mạnh, khụng tự ngưng kết thỡ giết chết bằng formol 2% hoặc đun 560
C/1h. Sau đú để tủ ấm 300C/24h rồi đem kiểm tra.
- Đem hỗn dịch chứa Leptospira chết hoàn toàn ly tõm hai lần: Lần 1 ly tõm 2000 vũng/phỳt trong 20 phỳt đ ể loại bỏ phần cặn hay gõy ngưng kết giả, sau đú lấy nước trong ly tõm lần 2 với tốc độ 6000 - 8000 vũng/phỳt trong 1h. Sau đú gạn bỏ 9/10 nước trong ở bờn trờn, phần xỏc ởđỏy ống đúng riờng từng chủng.
+ Tiến hành phản ứng:
- Mỗi một chủng khỏng nguyờn được làm trờn một phiến kớnh với huyết thanh nghi đó pha loóng ở cỏc nồng độ
- Nhỏ huyết thanh nghi đó pha loóng trờn phiến kớnh, sau đú nhỏ khỏng nguyờn lờn. Dựng đũa thuỷ tinh trộn đều. Để yờn ở nhiệt độ phũng thớ nghiệm, sau 10 phỳt đọc kết quả:
- Phản ứng dương tớnh: Leptospira bị ngưng kết tập trung thành cặn, lấm tấm trờn phiến kớnh, nước xung quanh trong.
- Phản ứng õm tớnh: Khụng cú hiện tượng ngưng kết, dung dịch đục đều.
Khi dựng khỏng nguyờn chết để chẩn đoỏn Leptospira nếu hiệu giỏ khỏng thểđạt từ 1/8 trở lờn thỡ chủng Leptospira đú được coi là chủng gõy bệnh, hiệu giỏ khỏng thể 1/4 là nghi ngờ.