II PHẢNỨNG HUYẾT THANH HỌC
3. Cỏc phảnứng huyết thanh học phải dựng kỹ thuật đỏnh dấu để phỏt hiện
Trong nhiều trường hợp để phát hiện sự kết hợp kháng nguyên - kháng thể, người ta phải dùng những chất đánh dấu như: chất phát huỳnh quang, enzyme, chất đồng vị phóng xạ... gắn vào kháng nguyên hoặc kháng thể, thì độ nhạy của phản ứng được tăng lên nhiều lần.
Những chất dùng để đánh dấu phải đạt tiêu chuẩn:
- Không được làm biến tính kháng nguyên, kháng thể.
- Không dễ bị bong ra sau khi gắn.
3.1. Phản ứng miễn dịch huỳnh quang (Immuno - fluorescent - test) IF
Dùng chất đánh dấu là chất phát huỳnh quang (khi hấp thụ 1 ánh sáng có bước sóng nhất định sẽ phát ra 1 ánh sáng có bước sóng dài hơn).
. Nguyên lý
Khi dùng kháng thể hoặc kháng kháng thể đã được nhuộm bằng chất phát huỳnh quang, rồi cho kết hợp với kháng nguyên cần chẩn đoán. Nếu có phức hợp kháng nguyên - kháng thể khi soi dưới kính hiển vi huỳnh quang sẽ phát sáng.
Có thể dùng các chất phát huỳnh quang sau để nhuộm kháng thể:
- Fluorescent Isothiocyanat: cho màu xanh lục
- Rodamin: màu đỏ gạch
- Lixamin: có màu đỏ gạch
- Rodamin B (RB200): màu vàng da cam Có 2 phương pháp: trực tiếp và gián tiếp. . Phản ứng miễn dịch huỳnh quang trực tiếp
Trong phản ứng này thường dùng kháng thể đặc hiệu nhuộm chất phát huỳnh quang để phát hiện kháng nguyên chưa biết.
Cách làm:
- Lấy bệnh phẩm cần chẩn đoán, làm thành tiêu bản (phiết bệnh phẩm lên phiến kính, cố định) để kháng nguyên gắn chặt lên phiến kính.
- Nhỏ một giọt kháng thể đặc hiệu đã gắn chất phát huỳnh quang lên tiêu bản.
- Để một thời gian 30 phút, rửa nước, để khô, quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang (ánh sáng tia tử ngoại). Đọc kết quả.
Có hiện tượng phát sáng do có sự kết hợp của kháng nguyên - kháng thể đã gắn chất phát huỳnh quang.
- Phản ứng âm tính:
Không có phát sáng, do không có sự kết hợp kháng nguyên - kháng thể. . Phản ứng miễn dịch huỳnh quang gián tiếp
Dùng kháng kháng thể được nhuộm chất phát huỳnh quang để phát hiện kháng nguyên cần chẩn đoán.
Phương pháp này còn gọi là kỹ thuật 2 lớp với 3 thành phần tham gia.
- Kháng nguyên cần chẩn đoán (kháng nguyên nghi).
- Kháng thể đặc hiệu.
- Kháng kháng thể đã gắn chất phát huỳnh quang. Trong đó kháng thể đặc hiệu có 2 chức năng:
- Là kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên cần chẩn đoán
- Là kháng nguyên của kháng kháng thể đã đánh dấu (kháng kháng thể là kháng thể kháng globulin cùng loài).
* Cách tiến hành:
- Lấy bệnh phẩm cần chẩn đoán làm tiêu bản để kháng nguyên gắn chặt lên phiến kính.
- Nhỏ một giọt kháng thể đặc hiệu lên phiến kính. Để tác động 15 phút, rồi rửa nước.
- Nhỏ tiếp 1 - 2 giọt kháng kháng thể đã gắn chất phát huỳnh quang.
Để tác động một thời gian, rửa nước, để khô, quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang. * Đọc kết quả:
- Phản ứng dương tính:
Có hiện tượng phát sáng, tức là có hiện tượng kết hợp kháng nguyên + kháng thể + kháng kháng thể, gia súc mắc bệnh.
- Phản ứng âm tính:
Không có hiện tượng phát sáng, tức là không có hiện tượng kết hợp kháng nguyên + kháng thể + kháng kháng thể. Bởi vì kháng nguyên và kháng thể không tương ứng, không có sự kết hợp kháng nguyên - kháng thể, kháng thể bị rửa trôi.
Tuy nhiên, phương pháp gián tiếp hay được sử dụng vì chỉ cần một lần gắn kháng kháng thể với chất huỳnh quang ta có thể sử dụng để chẩn đoán nhiềukháng nguyên khác nhau, với điều kiện kháng thể đặc hiệu của chúng phải được chế trên cùng một loài vật. Mặt khác, độ nhạy của phản ứng cao hơn, bởi vì 1 phân tử kháng nguyên có thể bị nhiều kháng kháng thể bám vào làm cho độ phát quang tăng lên, dễ phát hiện.
Hình 6.13. Phản ứng miễn dịch huỳnh quang
. Kỹ thuật Sandwich ("Bánh mì kẹp chả")
Đây là một dạng cải biến của miễn dịch huỳnh quang, dùng để phát hiện tế bào tạo kháng thể. Chất phát huỳnh quang Mẫu thí nghiệm Kháng thể Kháng nguyên Giá thể Kháng kháng thể gắn huỳnh quang Kháng thể gắn huỳnh quang Tế bào plasma Đèn cực tím Đèn cực tím Đèn cực tím
Lấy kháng nguyên phủ lên mảnh cắt. Để một thời gian, rửa nước, loại bỏ kháng nguyên chưa gắn với kháng thể đặc hiệu trên bề mặt tế bào lympho.
Nhỏ tiếp kháng thể đặc hiệu đã gắn chất phát huỳnh quang, để một thời gian, rửa nước, để khô, quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang. Đọc kết quả.
- Nếu có hiện tượng phát sáng, chứng tỏ các tế bào đang sản xuất kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên.
Phản ứng được ứng dụng trong chẩn đoán bệnh dịch tả lợn, Marerk, dại Ứng dụng trong chẩn đoỏn bệnh dại
* Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang trực tiếp
Dựng khỏng thểđặc hiệu nhuộm màu huỳnh quang để phỏt hiện khỏng nguyờn dại. Chuẩn bị:
- Chuẩn bị khỏng nguyờn nghi: dựng bệnh phẩm là nóo, nư ớc bọt hoặc ỏp kớnh vào vựng sừng Amon của động vật nghi mắc bệnh dại, cố định tiờu bản bằng ete hoặc hơ núng trờn ngọn lửa đốn cồn.
- Chuẩn bị khỏng thểđặc hiệu nhuộm huỳnh quang: dựng virus dại gõy tối miễn dịch cho thỏ, lấy mỏu chắt huyết thanh, tỏch phần gamma globulin (γIg) đem nhuộm màu huỳnh quang.
Tiến hành phản ứng:
- Nhỏ 1 - 2 giọt khỏng thểđó nhuộm màu huỳnh quang lờn tiờu bản, đểở 370C/30 phỳt, rồi đem rửa nước, làm khụ. Đọc kết quảdưới kớnh hiển vi huỳnh quang.
Kết quả:
- Phản ứng dương tớnh: Có hiện tượng phát sáng do có sự kết hợp của kháng nguyên -
kháng thể đã gắn chất phát huỳnh quang, con vật mắc bệnh dại
- Phản ứng âm tính: Không có hiện tượng phát sáng, do không có sự kết hợp kháng nguyên - kháng thể.
* Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang giỏn tiếp
Dựng khỏng khỏng thể đó nhuộm màu huỳnh quang để phỏt hiện khỏng nguyờn cần chẩn đoỏn.
Chuẩn bị:
- Chuẩn bị khỏng nguyờn nghi: giống như trong phản ứng trực tiếp.
- Chuẩn bị khỏng thể khỏng γIg: dựng γIg của thỏ tiờm cho gà trống, sau 2 - 3 tuần lễ, lấy mỏu gà, chắt huyết thanh, rồi tỏch phần γIg, sẽthu được khỏng khỏng thể khỏng γIg của thỏ, đem nhuộm màu huỳnh quang.
- Chuẩn bị khỏng thể đặc hiệu: giống như trong phản ứng huỳnh quang trực tiếp nhưng khỏng thể khụng nhuộm màu huỳnh quang.
Tiến hành phản ứng:
- Nhỏ 1 - 2 giọt khỏng thểđặc hiệulên phiến kính. Để tác động 15 phút, rồi rửa nước.
- Nhỏ tiếp 1 - 2 giọt kháng kháng thể đã gắn chất phát huỳnh quang.
Để tác động một thời gian, rửa nước, để khô. Đọc kết quảdưới kớnh hiển vi huỳnh quang. Kết quả:
- Phản ứng dương tính: Có hiện tượng phát sáng, tức là có hiện tượng kết hợp kháng nguyên + kháng thể + kháng kháng thể, con vật mắc bệnh. Trong bệnh phẩm có virus dại
- Phản ứng âm tính:Không có hiện tượng phát sáng, tức là không có hiện tượng kết hợp kháng nguyên + kháng thể + kháng kháng thể. Bởi vì kháng nguyên và kháng thể không tương ứng, không có sự kết hợp kháng nguyên - kháng thể, kháng thể bị rửa trôi. Con vật không bị bệnh dại.
ứng dụng phản ứng miễn dịch huỳnh quang chẩn đoán bệnh dịch tả lợn
- Chuẩn bị:
+ Kháng thể: là kháng thể dịch tả lợn đã nhuộm màu huỳnh quang
+ Kháng nguyên nghi: lấy bệnh phẩm của lợn nghi mắc bệnh dịch tả lợn (lách, hạch...) làm thành tiêu bản.
- Phương pháp tiến hành:
+ Nhỏ lên tiêu bản 1 - 2 giọt kháng thể dịch tả lợn đã nhuộm màu huỳnh quang, để trong hộp ẩm 1 giờở nhiệt độ 370C. Sau đó rửa nước, để khô và đọc kết quả dưới kính hiển vi huỳnh quang.
- Kết quả:
+ Phản ứng dương tính:
Có hiện tượng phát sáng do có sự kết hợp của kháng nguyên - kháng thể đã gắn chất phát huỳnh quang. Convật bị bệnh dịch tả lợn
+ Phản ứng âm tính:
Không có phát sáng, do không có sự kết hợp kháng nguyên - kháng thể. Con vật không mắc bệnh.
3.2. Phản ứng miễn dịch gắn enzyme ELISA (Enzyme linked Immuno Sorbent Assay)
3.2.1. Những hiểu biết chung về phản ứng ELISA
• Khỏi niệm
ELISA (Enzyme linked Immunosorbent Assay) là một kỹ thuật xột nghiệm miễn dịch dựa trờn cơ chế kết hợp đặc hiệu giữa khỏng nguyờn và khỏng thể (khỏng thể cú gắn enzyme) và dựng cơ chất đặc hiệu với enzym để phỏt hiện phức hợp khỏng nguyờn – khỏng thể.
• Nguyờn lý chung
Dựng khỏng thể hoặc khỏng khỏng thểđược gắn enzyme rồi cho kết hợp trực tiếp hoặc giỏn tiếp với khỏng nguyờn, sau đú cho cơ chất phự hợp với enzyme vào, enzyme sẽtỏc động đến cơ chất tạo màu, khi đọc trong quang phổ kế sẽ xỏc định được mật độ quang học và dựa trờn mật độ quang học người ta sẽđỏnh giỏ được mức độ của phản ứng.
Cỏc enzyme dựng cho phản ứng ELISA phải cú hoạt tớnh cao, người ta hay dựng Peroxydaza, Alkalin photphataza, Beta - galactosidaza. Cỏc cơ chất phải chọn sao cho phự hợp với enzyme, đểkhi tỏc động cú thểđo được màu ở quang phổ kế.
Peroxydaza là enzyme phổ biến trong ELISA để gắn với khỏng thể.
Cơ chất hay dựng là 3 3’ diamin benzidin, dưới tỏc dụng của oxy, peroxydaza sẽ cho màu nõu sẫm.
• Cỏc bước chuẩn bị cho phản ứng ELISA
+ Gắn khỏng nguyờn hoặc khỏng thể tạo KIT (pha rắn - Solid phase): Dựng khỏng nguyờn hoặc khỏng thểđó biết gắn lờn đĩa phản ứng để tạo KIT. Việc lựa chọn giỏ thểđểlàm ELISA đó cú nhiều thay đổi. Lỳc đầu người ta chọn cỏc que, ống, cỏc viờn bi với cỏc chất liệu khỏc nhau (thuỷ tinh, nhựa…) để làm giỏ thể. Nhưng sử dụng giỏ thể loại này rất cồng kềnh, mất nhiều thời gian, nờn người ta đó nghiờn cứu và đó đưa ra một loại giỏ thể thớch hợp cho ELISA, đú là bản nhựa 96 giếng. Với loại bản nhựa này cựng một lỳc cú thể kiểm tra được nhiều mẫu, tiện lợi trong sử dụng và khụng phải ly tõm.
Hiện nay, đĩa nhựa loại polystyrene được dựng khỏ phổ biến.
Người ta cho khỏng nguyờn hoặc khỏng thể hấp phụ thụ động lờn giỏ thể, phần kị nước (hydropholic) của khỏng nguyờn hoặc khỏng thể sẽ gắn với mặt rắn, phần ưa nước (hydrophilic) sẽ quay ra ngoài làm khỏng nguyờn hoặc khỏng thể sẽ gắn rất chặt vào giỏ thể.
Sự hấp phụ của khỏng nguyờn hay khỏng thể trờn giỏ thể nhiều hay ớt phụ thuộc vào cỏc yếu tố: - Hệ số khuyếch tỏn của cỏc phõn tửđược hấp phụ. - Tỷ lệ giữa diện tớch bề mặt của cỏc giếng và thể tớch của dung dịch gắn khỏng nguyờn. - Nồng độ dung dịch gắn khỏng nguyờn. - Thời gian hấp phụ khỏng nguyờn. - Nhiệt độ của quỏ trỡnh hấp phụ.
Sau đú tiến hành rửa đĩa đã gắn khỏng nguyờn hoặc khỏng thể, đõy là một khõu quan trọng, ảnh hưởng nhiều đến sự thành cụng của phản ứng. Bởi vỡ, nếu rửa khụng triệt để sẽ cũn sút lại khỏng nguyờn hoặc khỏng thể thừa và như vậy khụng loại bỏ được yếu tố liờn kết khụng đặc hiệu, điều đú sẽ làm sai lạc phản ứng. Để rửa đĩa, người ta phải lựa chọn một dung dịch đệm phự hợp. Hiện nay người ta sử dụng rộng rói dung dịch PBS (photphate buffer saline), Tween - 20 cú nồng độ 0,05% là dung dịch đệm tốt nhất. Tween - 20 vừa cú tỏc dụng loại bỏ những liờn kết khụng đặc hiệu, vừa cú tỏc dụng lấp chỗ trống trờn bề mặt giỏ thể.
+ Tạo Conjugate (liờn kết enzyme - khỏng thể)
Việc lựa chọn enzyme thớch hợp để chế conjugate cần đạt những tiờu chuẩn sau: + Enzym phải cú hoạt tớnh cao và ổn định;
+ An toàn, rẻ tiền, dễ kiếm;
Cơ chất KKT gắn enzym KT đặc hiệu virus Đĩa phản ứng Hình 6.15. Mô phỏng phản ứng
ELISA gián tiếp
Phổ biến hơn cả là Peroxydase và Alkalin photphataza.
Muốn tạo conjugate, enzyme khụng thể gắn trực tiếp với khỏng thể mà phải thụng qua tỏc nhõn gắn (cross linking agent). Cỏc tỏc nhõn này ớt nhất cú hai nhúm hoạt động, một nhúm sẽ kết hợp với khỏng thể và một nhúm sẽ kết hợp với enzyme. Cỏc tỏc nhõn hay được sử dụng là glutaraldehyde và periodate.
Độ pha loóng conjugate cú ảnh hưởng đến thời gian ủ và thời gian phản ứng với cơ chất. Khi conjugate pha loóng nhiều thỡ thời gian ủ dài và thời gian phản ứng với cơ chất lõu hơn.
+ Lựa chọn cơ chất: Mục đớch của việc lựa chọn cơ chất là làm sao cho cơ chất phải phự hợp với enzyme trong conjugate, cơ chất đạt yờu cầu phải an toàn, rẻ tiền, dễ sử dụng, cú hệ số tạo màu cao giỳp việc xỏc định sự kết hợp giữa khỏng nguyờn và khỏng thể dễ dàng. Người ta thường sử dụng những cơ chất như bảng dưới đõy:
Cỏc cơ chất thường dựng cho phản ứng ELISA
Cơ chất Dung dịch đệm Bước súng hấp phụ (nm) Sinh màu Khảnăng hoà tan trong nước ABTS (2,2’ azino - di - (3 ethylbenzthiazlinsulphonate (6)) Photphate/citrate pH 4,2 405 - 414 Xanh lỏ cõy Cú TMB 3,3’, 5,5’ tetramethyl benzidin Acetat pH 5,6 450 - 650 Xanh da trời đến vàng sau khi dừng phản ứng bằng acid Cú OPD (1,2 phenylenediamined hydro chloride Photphate/citrate pH 5,0 492 Da cam Cú Tuluidin Photphate/citrate pH 4,2 450 - 625 Xanh da trời vàng sau khi dựng phản ứng Cú 3.2.2. Cỏc dạng cơ bản của phản ứng ELISA
• Phản ứng ELISA trực tiếp (Direct ELISA)
Dùng để phát hiện kháng nguyên:
- Cho kháng nguyên cần chẩn đoán hấp phụ lên các lỗ bản nhựa, để một thời gian, rửa nước nhằm loại bỏ kháng nguyên không gắn.
- Cho kháng thể đặc hiệu đã gắn enzymevào, để một thời gian, rửa nước.
- Cho cơ chất đặc hiệu với enzymevào, để một thời gian.
- Cho chất dừng phản ứng vào. Đọc kết quả trên quang phổ kế.
+ Phản ứng dương tính: có màu xuất hiện tức làcó kháng nguyên tương ứng với kháng thể đặc hiệu. So màu trong quang phổ kế để định lượng mức độ của phản ứng.
+ Phản ứng âm tính: không xuất hiện màu.
+ Nhược điểm của phản ứng này là phải gắn Enzyme cho tất cả cỏc loại khỏng thể tương ứng dựng để tỡm cỏc loại khỏng nguyờn khỏc nhau, nờn người ta ớt dựng phản ứng này.
• Phản ứng ELISA gián tiếp (Indirect ELISA)
Dùng để phát hiện kháng thể
- Cho kháng nguyên đã biết hấp phụ lên bản nhựa, để một thời gian (qua đêm), rửa n-
E
Rửa nước Rửa nước
E Kháng thể Kháng nguyên Kháng thể gắn enzyme Cơ chất E Gắn kháng
nguyên Cho thể vàokháng chất vàoCho cơ
Hình 6.14. Mô phỏng phản ứng
Cơ chất Enzym KT gắn enzym Virus KT đặc hiệu của virus Đĩa phản ứng
- Cho huyết thanh cần chẩn đoán vào, để một thời gian, rửanước.
- Cho kháng kháng thể tương ứng gắn enzymevào, để một thời gian, rửa nước.
- Cho cơ chất đặc hiệu với enzyme vào, để một thời gian. Sau đú cho chất dừng phản ứng vào,đọc kết quả.
Phản ứng dương tính: Có xuất hiện màu. So màu trong quang phổ kế để định lượng mức độ của phản ứng.
Phản ứng âm tính: Không xuất hiện màu. • Phản ứng Sandwich ELISA
Có hai dạng phản ứng Sandwich ELISA là:
* Sandwich ELISA trực tiếp(Direct Sandwich ELISA)
Dùng để phát hiện kháng nguyên: Cỏc bước tiến hành:
+ Cho kháng thể đã biết hấp phụ lên các lỗ của bản nhựa, ủ một thời gian, rửa nước. + Cho kháng nguyên nghi vào, để một thời gian rồi rửa nước
+ Cho kháng kháng thể có gắn enzyme vào, để một thời gian, rửa nước, sau đó cho cơ chất đặc hiệu với enzimvào để một thời gian.
+ Cho chất dừng phản ứng vào. + Đọc kết quả trên quang phổ kế.
Phản ứng dương tính: Có xuất hiện màu. So màu trong quang phổ kế để định lượng mức độ của phản ứng.
Phản ứng âm tính: Không xuất hiện màu.
Hỡnh 6.16. Mụ phỏng phản ứng Sandwich ELISA trực tiếp