3. Yêu cầu nghiên cứu
3.5.2.Kết quả tách chiết DNA tổng số và phân tích PCR các dòng đậu tƣơng
toàn sinh học.
Hình 3.7. Biểu hiện của gen gfp được chuyển vào các giống đậu tương nghiên cứu
- Điểm phát sáng màu xanh (hướng mũi tên) là màu đặc trưng của gen gfp
3.5.2. Kết quả tách chiết DNA tổng số và phân tích PCR các dòng đậu tƣơng chuyển gen. chuyển gen.
Bảng 3.11. Số cây sau chọn lọc của một số giống đậu tƣơng
STT Tên giống Tổng số chồi Số chồi sống sót sau chọn lọc Số cây ra đất
1 DT2008 312 5 1 2 DT84 215 7 2 3 ĐVN9 334 12 4 4 ĐT26 154 2 4 5 DT96 236 15 2 Tổng cộng 1251 41 13 ĐVN9 ĐT26 DT2008 DT84
Sau khi chọn lọc 2 lần trên môi trường bổ sung hygromycin 20mg/l (mỗi lần chọn lọc 14 ngày) thu được 41/1251 chồi sống sót. Tiến hành cấy chuyển sang môi trường kéo dài và ra rễ tạo cây hoàn chỉnh. Lựa chọn cây đủ tiêu chuẩn (có bộ rễ khỏe mạnh, cao trên 5cm) đưa trồng trong bầu đất và chăm sóc trong điều kiện nhà lưới. Khi cây được 3-5 lá mới tiến hành lấy mẫu lá tách chiết DNA để phân tích PCR (phương pháp tách chiết DNA tiến hành theo Gewel và CS). Tổng số 13 cây được đưa ra ngoài nhà lưới và được ký hiệu thành các dòng tương ứng.
Kết quả tách chiết DNA tổng số của các dòng đậu tƣơng chuyển gen
DNA tổng số được điện di kiểm tra độ tinh sạch và chất lượng trên gel agarose 1%. Kết quả ở hình 3.8 cho thấy chất lượng DNA tổng số của các dòng đậu tương đảm bảo chất lượng để tiến hành cho phân tích PCR
Hình 3.8. Kết quả điện di DNA tổng số của các dòng đậu tương Ghi chú: 1: 08.1 2: 84.1 3: 84.2 4: VN 9.1 5: VN 9.2 6: VN 9.3 7: VN 9.4 8: 26.1 9: 26.2 10: 26.3 11: 26.4 12: 96.1 13: 96.2
Kết quả phân tích PCR các dòng đậu tƣơng chuyển gen
Để xác định sự có mặt của gen gfp trong các dòng đậu tương, chúng tôi sử dụng cặp mồi đặc hiệu để nhân đoạn gen có kích thước 600bp. Kết quả điện di sản phẩm PCR ở hình 3.9 cho thấy, trong tổng số 13 dòng được kiểm tra có 6 dòng xuất hiện băng điện di có kích thước phù hợp (600bp), bảng 3.12
Hình 3.9. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi gpf của các dòng đậu tương
Ghi chú:
M: Thang DNA chuẩn 1kb (+): mẫu dương tính (plasmid)
(-): mẫu âm tính (cây không chuyển gen) H2O: mẫu đối chứng không có DNA
1: 08.1 2: 84.1 3: 84.2 4: VN9.1 5: VN9.2 6: VN9.3 7: VN9.4 8: 26.1 9: 26.2 10: 26.3 11: 26.4 12: 96.1 13: 96.2
Bảng 3.12. Kết quả phân tích PCR các dòng đậu tƣơng chuyển gen với cặp mồi gfp
Giống thí
nghiệm Ký hiệu các dòng chuyển gen Kết quả PCR với cặp mồi gfp
DT2008 08.1 + DT84 84.1 - 84.2 + ĐVN9 VN9.1 + VN9.2 - VN9.3 - VN9.4 - ĐT26 26.1 + 26.2 + 600bp
26.3 - 26.4 - DT96 96.1 - 96.2 + Ghi chú: (+): kết quả PCR dương tính; (-): kết quả PCR âm tính.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1. KẾT LUẬN
Từ các kết quả thu được chúng tôi đưa ra một số kết luận sau:
1. Khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh của các giống đậu tương phụ thuộc nhiều vào giống. Trong tổng số 13 giống đậu tương khảo sát, chúng tôi lựa chọn được 2 giống (ĐT26, ĐVN 9) có khả năng tái sinh tương đối tốt: số chồi trung bình trên 3,2 và 3,7 chồi/mẫu; tỷ lệ đa chồi chiểm 69,4 và 78%; tỷ lệ ra rễ trên 97%; chiều dài rễ 5,9-6,8cm. Đây là những giống có thể sử dụng làm vật liệu cho nghiên cứu chuyển gen.
2. Một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen đậu tương được tối ưu hóa: - Chủng vi khuẩn thích hợp cho biến nạp gen ở đậu tương là AGL-1.
- Nồng độ vi khuẩn (OD600) thích hợp cho lây nhiễm từ 0,8-1,0 - Lây nhiễm kết hợp với lắc nhẹ 70-80 vòng/phút
- Thời gian đồng nuôi cấy từ 3- 5 ngày, ở 240C trong tối
- Nồng độ AS 200mg/l và L-cystein 400mg/l làm tăng hiệu quả biến nạp gen - Nồng độ làm tăng hygromycin 20mg/l có hiệu quả chọn lọc các dòng chuyển gen.
3. Hiệu quả biến nạp gen thông qua chủng vi khuẩn AGL-1 mang vector pX2-H vào 5 giống đậu tương (ĐVN9, ĐT26, DT84, DT2008, DT96) dao động từ 0,66 đến 3,74% khi kiểm tra sự biểu hiện của gen gfp. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
4. Phân tích PCR 13 dòng đậu tương được tạo ra từ các thí nghiệm chuyển gen ở 5 giống đậu tương nghiên cứu có 6 dòng cho kết quả dương tính với gen gfp, gồm: 08.1; 84.2; VN9.1; 26.1; 26.2; 96.2
2. ĐỀ NGHỊ
Cần tiếp tục nghiên cứu, thử nghiệm chuyển các gen quan tâm thông qua vi khuẩn mang vector pX2-H vào các giống đậu tương ĐVN9, ĐT26 và các giống khác dựa trên quy trình đã được tối ưu hóa để tạo ra cây đậu tương biến đổi gen.
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ
1. Nguyễn Tiến Dũng, Nguyễn Văn Đồng, Ngô Xuân Bình, Hà Văn Chiến (2010), Nghiên cứu khả năng tiếp nhận gen của một số giống đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) của
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Ngô Thế Dân, Trần Đình Long, Trần Văn Lài, Đỗ Thị Dung, Phạm Thị Đào (1999),
Cây đậu tương, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
2. Trần Văn Điền (2007), Cây đậu tương, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
3. Nguyễn Thúy Điệp, Kiều Thị Dung, Đặng Minh Trang, Lê Việt Chung, Đặng Trọng Lương, Trương Thị Thanh Mai (2005), “Kết quả nghiên cứu ban đầu về khả năng tái sinh của một số giống đậu tương phục vụ kỹ thuật chuyển gen”, Tạp chí Nông nghiệp và phát triển nông thôn, 20: 35-38
4. Nguyễn Văn Đồng, Phạm Thị Lý Thu, Tạ Kim Nhung, Trịnh Thị Minh Thùy, Hà Văn Chiến, Lê Thanh Nga, Lê Thị Thu Về, Lê Thị Thu Hiền, Nông Văn Hải, Lê Huy Hàm (2010), “Kết quả bước đầu trong nghiên cứu chuyển gen kháng sâu cry1Ac vào phôi non các dòng ngô mô hình”, Tạp chí Công nghệ Sinh học 8(1):1-8.
5. Nguyễn Thu Hiền, Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Phú Hùng, Lê Thị Thanh Hương (2005), “Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh hóa và nhân gen dehydrin của một số giống đậu tương địa phương vùng núi phía Bắc Việt Nam”. Báo cáo khoa học Hội nghị toàn quốc – Nghiên cứu cơ bản trong khhoa học sự sống - Đại học Y Hà nội. NXB KHKT Hà nội, 2224 – 2227.
6. Lê Thị Thu Hiền, (2003), Tạo chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang gen kháng côn trùng để chuyển vào cây trồng, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
7. Trần Thị Cúc Hòa (2007), “Nghiên cứu khả năng đáp ứng chuyển nạp gen của các giống đậu tương trồng ở Việt Nam”, Tạp chí Nông nghiệp & phát triển nông thôn 18: 9-14.
8. Trần Thị Cúc Hòa (2008), “Hiệu quả tạo dòng đậu tương biến đổi gen từ giống MTĐ 176, HL 202, Maverick và William 82 bằng phương pháp nốt lá mầm qua trung gian Agrobacterium tumefaciens”, Tạp chí Nông nghiệp & Phát triển nông thôn, 1: 14-19.
9. Nguyễn Huy Hoàng (1992), Nghiên cứu khả năng chịu hạn của các giống đậu tương nhập nội ở miền Bắc Việt Nam, Luận án phó tiễn sỹ, Hà nội
10. Trần Thị Phương Liên (1999), Nghiên cứu đặc tính hóa sinh và sinh học phân tử của một số giống đậu tương có khả năng chịu nóng, chịu hạn ở Việt Nam, Luận án tiến sỹ sinh học, Viện công nghệ sinh học, Hà nội.
11. Trần Đình Long (2000), Cây đậu tương, NXB Nông nghiệp, Hà Nội
12. Chu Hoàng Mậu (2001), Sử dụng phương pháp đột biến thực nghiệm để tạo các dòng đậu tương và đậu xanh thích hợp cho miền núi Đông Bắc Việt Nam, Luận án tiến sỹ sinh học, Viện công nghệ sinh học, Hà nội
13. Nguyễn Đức Thành (2003), Chuyển gen ở thực vật, NXB KHKT, Hà Nội 14. Tổng cục thống kê (2010), Niên giám thống kê 2009, NXB Thống kê, Hà Nội.
15. Phạm Thị Lý Thu (2007), Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh từ phôi non và xác định phương pháp chuyển gen thích ở ngô, Luận án tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Tiếng Anh
16. A. F. Garay và Wallace Wilhelm (1983), “Root System Characteristics of Two Soybean Isolines Undergoing Water Stress Condition”, Agronomy Journal, Vol. 75.
17. Aiqiu Xing, Zhang Yuan Zhang, Shirley Sati, Paul Staswick and Tom Clemente (2000), “The use of the two T-DNA binary system to derive marker-free transgenic soybean”, InVitro Cell. Dev. Biol.Plant 36:456-463
18. Birch R.G. (1997), “Plant transformation- problems and strategies for practical application”. Ann Rev Plant Physiol Plant (48), pp. 297–326.
19. Bravo Angel A.M., Hohn B., Tinland B. (1998), “The omega sequence of virD2 is important but not essential for efficient of the T-DNA by Agrobacterium tumefaciens”,
Molecular Plant Microbe Interactions (11), pp. 57-63.
20. Breitler J-C., Maynard D., Boxte J.V., Royer M., Bonot F., Cambillau L., Guiderdoni E. (2004), “A novel two T-DNA binary vecror allows efficient generation of marker-
free transgenic plant in three elite cultivars of rice (Oryza sativa L.), Transgenic Research.13: 271-278.
21. C. A. Meurer, R. D. Dinkins and G. B. Collins (1998), “Factors affecting soybean cotyledonary node transformation”, Plant Cell Reports, 18: 180–186 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
22. Calvo, E.S., Kiihl, R.A.S., Garcia, A., Harada, A., Hiromoto, D.M. (2008). “Two major recessive soybean genes conferring soybean rust resistance”. Crop Science 48, 1350–1354.
23. Chalfie M., Y. Tu, G. Euskirchen, W. W. Ward, and D. C. Prasher (1994), “Green fluorescent protein as a marker for gene expression”. Science 263: 802 – 805
24. Chao Yang, Tuanjie Zhao, Deyue Yu and Junyi Gai. (2009), “Somatic embryogenesis and plant regeneration in Chinese soybean (Glycine max (L.) Merr.) impacts of mannitol, abscisic acid, and explant age”, In Vitro Cell.Dev.Biol.-Plant 45:180–188. 25. Charest P. J., V. N. Iyer, and B. L. Miki (1989), “Factors affecting the use of
chloramphenicol acetyltransferase as a marker for Brassica genetic transformation”.
Plant Cell Reports 7: 628-631
26. Chen WS, Chiu CC, Liu HY, Lee TL, Chen JT, Lin CC, Wu YJ, and Chang HY (1998), “Gene transfer via pollen-tube pathway for anti-fusarium wilt in watermelon”.
Biochem Mol Biol Int. 46: 1201-1209.
27. Cheng M., Lowe B.A., Michael S.T., Ye X.X. and Armstrong C.L.(2004), “Factors influencing Agrobacterium-mediated transformation of monocotyledonous species”, In vitro Cel. & Dev. Bio-plant 40 (1): 31-45.
28. Chowrira, G.M., Akella, V., and Lurquin, P.F (1995), “Electroporation-mediated gene transfer into intact nodal meristems in planta”. Mol.Biotechnol.3: 17-23.
29. Christianson, M.L., Warnick, D.A., và Carlson, P.S. (1983), “A morphogenetically competent soybean suspension culture”. Science 222:632-634
30. Chumakov M.I., Rozhok N.A., Velicov V.A., Tyrnov V.S, Volokhina I.V. (2006), "Agrobacterium - Mediated in planta transformation of maize via pistil filaments"
31. Cohen J. D., T. R. Eccleshall, R. B. Needleman, H. Federoff, B. A. Bucferer, and J. Marmur (1980), “Functional expression in yeast of the Escherichia-coli plasmid gene coding for chloramphenicol acetyl transferase”. Proceedings of the National Academy of Sciences 77: 1078-1082.
32. Corinne Zurbrugg, Wolfgang Netwig (2009), “Ingestion and excretion of two transgenic BT corn varieties by slugs”, Transgenic Res., 18: 215-225.
33. Cristia V. and Cachita-Cosma D (1992), “Studies on the reactivity of different soybean explants types (Glycine max L. Merr.) to in vitro culture conditions”. Revue Roumaine de Biologie Serie Vegetale 37: 73-81.
34. Daley M, Knauf VC, Summerfelt KR and Turner JC (1998), “Co-transformation with one Agrobacterium tumefaciens strain containing two binary plasmids as a method for producing marker-free transgenic plants”. Plant Cell Rep 17: 489–496.
35. DeCleene, M., and DeLay, J. (1976) “The hot range of crown gall”. Bot Gaz 42: 389- 466.
36. Delzer, B.W., Somers, D.A., and Orf, J.H. (1990), “Agrobacterium tumefaciens
susceptibility and plant regeneration of 10 soybean genotype in maturity group 00 to II”. Crop Sci. 30: 320-322.
37. Di Nocera P. P. and I. B. Dawid (1983), “Transient expression of genes introduced into cultured cells of Drosophila”. Proc. Natl. Acad. Sci. 80: 7095-7098
38. Di, R., Purcell, V., Collins, G.B., and Ghabrial, S.A (1996), “Production of transgenic soybean lines expressing the bean pod mottle virus coat protein precursor gene”. Plant Cell Rep. 15: 746-750
39. Droste, A., Bodanese Zanetti, M.H., Mundstock, E., and Hu, C.Y., (1994), “Susceptibility of Brazil soybean cultivars to Agrobacterium tumefaciens”. Rev. Brail. Genet. 17:83-88.
40. Duan XL and Chen SB (1985), “Variation occurring by introduction of the exogenous DNA into rice”. Sci Agric Sin 18: 6-10.
41. Ebinuma H., and Komanima A. (2001), “MAT (Multi-auto-transformation) vector system. The oncogenes of Agrobacterium tumefaciens strain contaning two binary
plasmid as a method for producing marker-free transgenic plant”, Plant Cell Rep. 17: 489-496.
42. FAOSTAT (2009) http://faostat.fao.org/faostat/notes/citation.htm/online.
43. Fernandez D., Spudich G.M., Zhou X.R., Berger B.R., Christie P.J. (1996), “Agrobacterium tumefaciens VirB7 lipoprotin is required for stabilization of VirB
proteins during assembly of the T-complex transport apparatus”, Journal of Bacteriology (178), pp. 3168-3176.
44. Finer, J.J (1988), “Apical proliferation of embryogenic suspension culture of soybean (Glycine max Merrill)”, Plant Cell Tissue Organ Cult. 15: 125-136.
45. Finer, J.J và McMullen, M.D. (1991), “Transformtion of soybean via particle bombardment of embryogenic suspension culture tissue”. Invitro Cell Dev.Biol. 27p:175-182.
46. Fromm, M., Taylor, L.P., and Walbot, V. (1985), “Expression of gene transferred into monocot and dicot plant cells by electroporation”. Proc.Natl.Acad. Sci.USA. 82: 5824- 5828. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
47. Genlvin S.B. (2000), “Agrobacterium and plant genes involved in T- DNA transfer and intergration”, Rev Plant Physiol Biology (51), pp. 223-256.
48. Grebenok R. J., G. M. Lambert, and D. W. Galbraith (1997), “Characterization of the targeted nuclear accumulation of GFP within the cells of transgenic plants”. The Plant Journal 12: 685 – 696
49. Gustavo A., Cabrera J., (1998), “The Agrobacterium tumefaciens: a natural tool for plant transformation”, Plant Cell Report (26), pp. 1-11.
50. Hadi, M.Z., McMullen, M.D., and Finer, J.J. (1996), “Transformation of 12 diffirent plasmids into soybean via particle bombardment”. Plant Cell Rep. 15: 500-505
51. Hai-Kun Liu, Chao Yang, Zhi-Ming Wei (2004), “Efficient Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of soybeans using an embryonic tip regeneration system”, Planta, 219: 1042–1049
52. Hansen, G., Das, A., and Chilton, M.D (1994), “Constitutive expression of the virulence genes improves the efficiency of plant transformation by Agrobacterium”. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91: 7603-7607.
53. Haseloff J. and K. R. Siemering (1998), “The uses of green fluorescent protein in plants. In Green Fluorescent Protein: Properties, Application, and Protocols, M. Chalfie, and S. Kain, eds. (Wiley-Liss, Inc.), pp. 191 - 219.
54. Haseloff J., K. R. Siemering, D. C. Prasher, and S. Hodge (1997), “Removal of a cryptic intron and subcellular localization of green fluorescent protein are required to mark transgenic Arabidopsis plants brightly”. Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 2122 -2127 55. Heim R., D. C. Prasher, and R. Y. Tsien (1994), “Wavelength mutations and
posttranslational autoxidation of green fluorescent protein”. Proceedings of the National Academy of Sciences 91: 12501 - 12504
56. Herrera-Estrella L., G. Van Den Broeck, R. Maenhaut, M. Van Montagu, J. Schell, M. Timko, and A. Cashmore (1984), “Light inducible and chloroplast associated expression of a chimeric gene introduced into Nicotiana-tabacum using a Ti plasmid vector”. Nature 310: 115-120
57. Hille J., Wullems G., Schiperoort R.A., (1983), “Non-oncogenic T- Region mutants of
Agrobacterium tumefaciens do transfer T-DNA into plant cells”, Plant Molecular Biology (2), pp. 155-163.
58. Hinchee, M.A.W., D.V.Connor-Ward, C.A.Newell, R.E.McDonnell, S.J.Sato, C.S.Gasser, D.A.Fischhoff, D.B.Re, R.T.Fraley, and R.B.Horsch (1988), “Production of transgenic soybean plants using Agrobacterium-mediated gene transfer”,
Bio/Technol. 6:915-922.
59. Hookaas P.J.J., and Beijersbergen, A.G.M (1994), “The virulence system of
Agrobacterium tumefaciens”. Ann.Rev. Phytopathol. 32: 157-179
60. Hooykass P.J.J., Schilperoort, R.A. (1992), “Agrobacterium and plant genetic engineering”, Plant Molecular Biology (35), pp. 205-218
61. Hu CY and Wang LZ (1999), “In planta soybean transformation technologies developed in China: Procedure, confirmation and field performance”. In Vitro Cell Dev Biol Plant 35: 417-420.
62. Huixia Shou, Reid G. Palmer and Kan Wang (2002), “Irreproducibility of the Soybean Pollen-Tube Pathway Transformation Procedure”, Plant Molecular Biology Reporter
20: 325–334
63. Hymowitz T. and Newell C.A. (1981), “Taxonomy of the genus Glycine domestication and uses of soybeans”, Economic Botany, 35, pp.272-288.
64. Jefferson, R.A., T.A. Kavanagh and M.V. Bevan (1987), “GUS fusions: β- glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants”, The EMBO Journal vol.6 no. 13 pp.3901 -3907.
65. Joerbo M., Donaldson I., Kreiberg J., Peterson S.G., Brunstedt J.and Okkels F.T. (1998), “Analysis of mannose selection used for transformation of suger beet”,
Molecular Breed (4), pp. 111-117
66. John J. Finer và Akitsu Nagasawa (1988), “Development of an embryogenic suspension culture of soybean (Glycine max Merrill.)”, Plant Cell, Tissue and Organ Culture 15:125-136
67. Jorgensen, R.A., Cluster, P.D., English, J., Que, Q., and Napoli, C.A. (1996), “Chalcone synthase cosuppression phenotype in petunia flowers: comparison of sense vs. antisense constructs and single-copy vs. complex T-DNA sequences”. Plant Mol.Biol. 31: 957-973.
68. Komari T, Hiei Y, Saito Y,Murai N and Kumashiro T (1996), “Vectors carrying two