3. Yêu cầu nghiên cứu
2.3.5. Ph-¬ng ph¸p ®iÖn di trªn gel agarose
Nguyên tắc: Phương pháp điện di dựa vào đặc tính cấu trúc của các nucleic acid. Nucleoic acid là các đại phân tử tích điện âm, nên dưới tác động của dòng điện một chiều các đoạn DNA có khối lượng và kích thước khác nhau sẽ di chuyển trong điện trường từ cực âm sang cực dương.
Hóa chất: Agarose 1,0% (hòa 1,0g agarose trong 100ml dung dịch đệm TAE 1X). Đệm TAE 1X, EtBr 10mg/ml, đệm tra mẫu (glycerol 20%; tris- HCl 0.1M, pH 8.0; EATA 0.01 M, pH 8.0; Bromophenol blue 0.25%).
Quy trình: Agarose 1,0% được đun sôi, để nhiệt độ hạ xuống khoảng 50- 60oC. Bổ sung EtBr vào bản gel với nồng độ 10µg/ml , đổ dung dịch vào khay gel đó cài sẵn răng lược thích hợp. Sau 30-60 phút, khi gel đó đông cứng, tháo răng lược, đặt khay gel vào bể điện di. Đổ đệm TAE 1X ngập cách mặt gel ~2mm. Mẫu DNA trộn cùng với đệm tra mẫu theo tỷ lệ thích hợp, tra mẫu vào các giếng trên bản gel. Tiến hành điện di với dòng điện một chiều có hiệu điện thế 80v, cường độ dòng điện vào khoảng 60-80mA. Theo dõi sự di chuyển của vệt màu bromophenol blue để ngừng vào thời gian phù hợp (thường sau khoảng 30 phút). Gel được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại, DNA được hiện lên dưới dạng các vạch sáng, ảnh điện được di được chụp trên máy Bio-Rad với tia UV có bước sóng 320nm.
2.3.6. Phƣơng pháp nuôi cấy tái sinh cây hoàn chỉnh
Hình 2.2. Sơ đồ quy trình tái sinh cây đậu tương từ nốt lá mầm
H HHạạạttt đđđậậậuuu tttưưươơơnnnggg K KKhhhửửử tttrrrùùùnnnggg bbbềềề mmmặặặttt N NNuuuôôôiii cccấấấyyy nnnảảảyyy mmmầầầmmm G
GGâââyyy tttổổổnnn ttthhhưưươơơnnnggg lllááá mmmầầầmmm,,, nnnuuuôôôiii cccấấấyyy nnnảảảyyy c
cchhhồồồiii t
ttrrrêêênnn mmmôôôiii tttrrrưưườờờnnnggg ccchhhứứứaaa BBBAAAPPP C CCắắắttt bbbỏỏỏ lllááá mmmầầầmmm,,, ccchhhuuuyyyểểểnnn sssaaannnggg m mmôôôiii tttrrrưưườờờnnnggg kkkéééooo dddàààiii ccchhhồồồii i C CChhhuuuyyyểểểnnn sssaaannnggg m mmôôôiii tttrrrưưườờờnnnggg rrraaa rrrễễễ R RRaaa cccâââyyy
Nuôi cấy nảy mầm hạt
Hạt đậu tương được khử trùng sơ bộ bằng cồn 70% trong thời gian 3 phút. Tiếp đến hạt được khử trùng 15 phút trong dung dịch NaOCl 15%. Sau đó tráng sạch hạt bằng nước cất khử trùng 3-4 lần. Đưa hạt ra đĩa petri, dùng dao số 11 tách bỏ vỏ ngoài và nuôi cấy nảy mầm hạt trên môi trường GM (bảng 2.1).
Tạo mẫu nuôi cấy và tái sinh chồi (mẫu sử dụng khi biến nạp gen)
Vật liệu dùng để nuôi cấy tái sinh là nốt lá mầm của cây invitro sau nảy mầm 3-5 ngày. Phương pháp tạo vật liệu và lây nhiễm được tiến hành theo Olhoft P.M. và cộng sự (2003) [91], Zeng (2004) [126] có cải tiến cho phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm.
Hạt đậu tương sau nảy mầm 3-5 ngày được loại bỏ toàn bộ trụ dưới lá mầm. Dùng dao tách đôi hai lá mầm, sao cho mỗi lá mầm chứa ½ chồi đỉnh (sau đây gọi là mẫu nuôi cấy). Mẫu nuôi cấy được cắt bỏ chồi đỉnh và gây tổn thương xung quanh mặt trong nốt lá mầm bằng mũi dao số 11 (7-10 vết thương/mẫu). Sau khi gây tổn thương, mẫu nuôi cấy được nuôi cấy trên môi trường có bổ sung BAP 1,5mg/l (bảng 2.1) để kích thích khả năng tái sinh tạo đa chồi. Điều kiện chiếu sáng 18h/ngày, ở 250
C. Kéo dài chồi
Tách riêng biệt các chồi từ cụm chồi thu được chuyển sang môi trường kéo dài (SEM) có bổ sung GA3 (bảng 2.1). Nuôi 4 tuần ở chế độ 250
C, với 18/6h sáng/tối trong tủ nuôi cây.
Tái sinh cây hoàn chỉnh
Khi chồi phát triển có chiều dài khoảng trên 4 cm được chuyển sang môi trường tạo rễ RM (bảng 2.1) nuôi sáng ở 250C, thời gian từ 2-3 tuần.
Chuyển cây ra cát
Cây tái sinh trên môi trường RM có 3-4 rễ, cao 5-7 cm được chuyển ra cát trồng, tưới nước thường xuyên.