3. Yêu cầu nghiên cứu
1.7.2. Phương pháp biến nạp gen ở đậu tương
Chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium
Đây là phương pháp sử dụng vi khuẩn Agrobacterium như một vector sinh học để biến nạp một phần DNA của chúng vào hệ gen thực vật, kết quả là tạo được cây biến đổi gen [60], [125]. Agrobacterium xâm nhiễm vào cây trồng thông qua vết thương. Khi bị tổn thương, mô thực vật sẽ tiết ra hợp chất phenol, hợp chất này sẽ dẫn dụ vi khuẩn Agrobecterium biểu hiện gen vùng vir [59]. Kết quả biểu hiện của gen Vir, sợi đơn T-DNA sẽ được chuyển và tổng hợp trong hệ gen thực vật. Vấn đề chính của phương pháp chuyển gen này là sự kết hợp giữ tế bào chủ với vector tương ứng.
Mặc dù ban đầu đậu tương không phải là đối tượng được xem xét để lây nhiễm với vi khuẩn [35] cho tới khi Pederson và cộng sự (1983) [103] đã chứng minh đậu tương là vật chủ thích hợp với loại vi khuẩn này. Tuy nhiên, hiệu quả chuyển gen vẫn
bị kiểm soát bởi yếu tố giống [36], [97]. Mặt khác, khả năng thu được các chồi chuyển gen từ những khối mô có khả năng tái sinh như phôi vô tính và nốt lá mầm ban đầu rất thấp. Để nâng cao hiệu quả chuyển gen ngày càng có nhiều nghiên cứu nhằm tối ưu quy trình như: bổ sung hợp chất có vai trò xúc tác như acetosyringone để kích thích sự biểu hiện của gen Vir, L-cystein [95], thiol [94] hoặc sử dụng các chủng vi khuẩn có khả năng gây độc tính cao [52], xác định các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen thông qua nốt lá mầm [21], [101], cải tiến nốt lá mầm làm vật liệu biến nạp [85], kết hợp lây nhiễm với tái sinh [99]. Vấn đề khác khi sử dụng vi khuẩn Agrobacterium
còn phụ thuộc vào chủng khuẩn [100], số lượng bản DNA copy được tổng hợp trong hệ gen thực vật [104], [115], pH môi trường [107], mức độ gây tổn thương của mẫu [107], [110]. Trái ngược với các phương pháp chuyển DNA trược tiếp có thể cho kết quả với số bản copy nhiều hơn, có thể là các mảnh hoặc các đoạn được kết hợp trong một khuân mẫu không được kiểm soát.
Những cây đậu tương chuyển gen đầu tiên được tạo ra bằng phương pháp nốt lá mầm sử dụng vi khuẩn Agrobacterium làm trung gian được báo cáo vào năm 1988 [58]. Nốt lá mầm của giống Peking được lây nhiễm với chủng vi khuẩn Agrobacterium
mang gen chỉ thị gus, gen kháng kanamycin và glyphosate. Mẫu được nuôi cấy trên môi trường có chứa BAP để cảm ứng tạo chồi, kanamycin cùng với các kháng sinh khác có tác dụng loại bỏ lượng vi khuẩn còn lại sau khi đồng nuôi cấy. Sau một vài tháng, cây con được tái sinh và được kiểm tra thông qua sự biểu hiện của gen gus hoặc khả năng kháng glyphosate. Chỉ 6% tổng số chồi lựa chọn được chuyển gen. Tám cây được tái sinh và phân tích, kết quả cho thấy chúng có một sợi DNA chèn vào. Mặc dù sự biến nạp cho hiệu quả không cao nhưng báo cáo chỉ ra rằng có thể tái sinh các tế bào chuyển gen của một giống đậu tương khi được lây nhiễm với vi khuẩn
Agrobacterium thích hợp.
Townsend và Thomas (1993) [116] sử dụng quy trình tương tự đã thu được cây chuyển gen từ giống Pioneer 9341. Các yếu tố quan trọng giúp họ thành công đó là (1) sử dụng chất acetosyringone, (2) giới hạn nhiệt độ giai đoạn đồng nuôi cấy được kiểm
soát trong khoảng 18-280C, (3) mật độ tế bào vi khuẩn lây nhiễm từ 108
đến 3 x 109/ml, (4) sử dụng axit pyroglutamic để bổ sung vào trong môi trường tái sinh.
Gần đây vi khuẩn Agrobacterium và nốt lá mầm cũng được sử dụng để chuyển gen tổng hợp protein vỏ của virus Bean Pod Mottle (một loại vius rây bệnh đốm vỏ trên hạt đậu) vào đậu tương [38]. Tuy nhiên, tỷ lệ chuyển nạp gen thấp, chỉ có 5 cây chuyển gen sơ khởi của 5 lá mầm khác nhau được tạo ra từ 400 lá mầm ban đầu. Phân tích Southern cho thấy sự tích hợp gen BPMVCP-P vào bộ gen và thể hiện qua các cây R1. Khoảng 30% cây R2 có nguồn gốc từ 1 dòng chuyển gen ban đầu được xét nghiệm ELISA (Enzym-linked Immuno Sorbent Assay) cho thấy khả năng kháng hoàn toàn với virus này. Tính trạng hình thái không bị biến đổi so với thế hệ R1.
Parrott và cộng sự (1989) [97] đã đưa ra một phương pháp chuyển gen khác đó là sử dụng vi khuẩn Agrobacterium lây nhiễm với mẫu mô lá mầm hạt non để tạo phôi vô tính sau đó tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Ba cây chuyển gen có chứa gen zein kích thước 15kD được hình thành. Tuy nhiên, những cây chuyển gen này đều bị khảm và khi phân tích các cây ở thế hệ sau không thấy có một cây nào có chứa gen zein 15kD.
Gần đây, một phương pháp mới và có khả năng cho hiệu quả hơn đã được phát triển để biến nạp vi khuẩn Agrobacterium mang gen vào thẳng tế bào mô đích. Kỹ thuật mới này gọi là SAAT (Sonicate Assisted Agrobacterium – media transformation) [119]. Sử dụng SAAT với nuôi cấy huyền phù phát sinh phôi vô tính đã cho hiệu quả chuyển gen ổn định và không có hiện tương thể khảm. Phương pháp này có ưu điểm là thời gian nuôi cấy cộng sinh mô thực vật với A.grobacterium được rút ngắn. Với kỹ thuật hiển vi điện tử quét, nhóm tác giả khám phá ra SAAT, tạo ra những rãnh và khe nhỏ giống nhau, xuyên qua mô, cho phép Agrobacterium dễ dàng đi vào mô đích mong muốn không giống như phương pháp chuyển nạp gen khác. Sử dụng kỹ thuật SAAT để chuyển gen vào đỉnh sinh trưởng đã làm gia tăng hiệu quả chuyển nạp gen tạm thời trong nhiều cơ quan như: lá, nốt lá mầm, phôi hữu tính, phôi vô tính, rễ, thân, chồi, hạt qua sự thể hiện GUS tăng gấp 100-400 lần trên cây Ohio buckeye, đậu đũa (cowpea), cây vân sam trắng (white spruce), lúa mì, ngô và đậu tương, đồng thời gen chuyển nạp tương đối ổn định qua các thế hệ. Cũng với phương pháp trên C. A. Meurer
và các cộng sự (1998) [21] áp dụng trên 28 giống đậu tương. Nhóm tác giả cho rằng, để thực hiện thành công phương pháp SAAT thì cần khảo sát các yếu tố như: chủng vi khuẩn, xác định tế bào chủ và khả năng tiếp nhận gen của mô mong muốn. Với phương phương pháp SAAT, chọn những cụm phôi có 10-20 phôi (đường kính 2-4 mm) được lây nhiễm với 1 ml dịch khuẩn A.tumefaciens có nồng độ OD600 =0,1-0,5 trong thời gian 0-300 giây. Sau 2 ngày trên môi trường lây nhiễm có 0,1mM Acetosyringone mẫu được chuyển lên môi trường chứa 400 mg/l timentin. Hai tuần sau khi SAAT, chuyển mô sang môi trường có 20 mg/l hygromycin và 400 mg/l Timentin. Những dòng chuyển gen được quan sát và phân lập khoảng 6-8 tuần sau khi SAAT.
Kỹ thuật này cho hiệu quả chuyển gen cao hơn so với các phương pháp chuyển gen khác. Mở ra một hướng mới sử dụng vi khuẩn Agrobacterium để biến nạp gen cho các mô đích khác nhau.
Sử dụng súng bắn gen
Kỹ thuật bắn gen dựa trên gia tốc của các hạt bọc DNA về phía tế bào thực vật. Nhờ có gia tốc lớn mà các hạt DNA có thể đâm xuyên qua thành tế bào và màng tế bào. Bên trong tế bào, DNA được phân tách từ các hạt nhỏ và tổng hợp ở trong hệ gen thực vật. Ưu điểm của súng bắn gen là có thể loại bỏ các tác nhân sinh học không thích hợp, đặc biệt là với những loại mẫu không thích hợp với chuyển gen bằng vi khuẩn
Agrobacterium. Phương pháp này cho phép chuyển trực tiếp gen quan tâm vào mô phân sinh đỉnh của thực vật. Tuy nhiên, phương pháp này yêu cầu phải có dụng cụ, máy móc chuyên dụng có thể phân chia chính xác các hạt DNA sâu trong mô phân sinh đích [87]. Báo cáo đầu tiên về chuyển gen bằng súng bắn gen vào đậu tương sử dụng chồi phân sinh đỉnh làm mô đích được McCabe và cộng sự tiến hành năm 1988 [87]. Chồi đỉnh sau khi biến nạp được cảm ứng tạo đa chồi trước khi tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Phân tích khối mô chuyển gen nhận thấy có các hạt nhỏ mang DNA và có sự tái tổ hợp DNA trong tế bào chủ [50], [83], [87]. Khả năng tổng hợp DNA trong tế bào được xem như biểu hiện của quá trình chuyển gen có hiệu quả [67].
Phương pháp chuyển gen bằng xung điện
Sử dụng xung điện cho hiệu quả biến nạp khá cao đối với tế bào động vật. Fromm và cộng sự (1985) [46] lần đầu tiên cho rằng có thể cải tiến phương pháp này để biến nạp gen vào thực vật. Năm 1985, nhóm tác giả đã sử dụng kỹ thuật xung điện để chuyển gen vào tế bào trần của cây ngô và họ đã thu được cây ngô chuyển gen bền vững bằng phương pháp này [46]. Cùng với các thí nghiệm thu được trên cây thuốc lá của nhiều tác giả khác, phương pháp này đã được sử dụng để chuyển gen cho cây đậu tương [98].
Tế bào trần đậu tương được xung điện đảm bảo mật độ 2-4 x 106
tế bào trên/ml môi trường Kao bổ sung 40mM NaCl (Kao, K. N., 1977). Một mililít dung dịch huyền phù tế bào trần được hút cho vào cuvet 1,5ml và làm lạnh trong thời gian ngắn trên đá. Dòng điện xung phát ra từ các sợi bạch kim có khoảng cách 1cm. Dòng điện này được cung cấp bởi một tụ điện 490 µF (Sprague Power- lytic 36D, Marsh Electronics, Milwaukee, WI) và là nguồn cung cấp điện áp ổn định. Điện thế được điều chỉnh bằng một vôn kế.
Chowrira và cộng sự (1995) [28] sử dụng phương pháp xung điện để biến nạp gen vào điểm sinh trưởng của cây mầm đậu tương. Cây mầm 7-10 ngày được loại bỏ lá mầm, DNA được tiêm vào đỉnh chồi bằng hệ thống ống tiêm có chứa dung dịch lipofectin. DNA được chuyển vào bằng một dòng điện xung, cây sinh trưởng mà không cần tác nhân chọn lọc. Quá trình này đã được thực hiện trên nhiều mô phân sinh và thu được một vài thể khảm. Đây là phương pháp khá hay nhưng việc ứng dụng còn nhiều hạn chế.
Phương pháp chuyển gen qua ống phấn
Hầu hết các phương pháp chuyển gen hiện tại đều dựa trên cơ sở nuôi cấy mô tế bào, nó đòi hỏi các tế bào chuyển gen phải được tái sinh thành cây [18]. Phát triển một hệ thống chuyển gen độc lập với nuôi cấy mô tế bào đã giành được nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học. Cách tiếp cận này cho phép vượt qua rào cản về kiểu gen của cây biến nạp vốn ảnh hưởng rất nhiều đến hiệu quả chuyển gen. Mặt khác chi phí tài chính và thời gian chọn tạo sẽ được rút ngắn. Phương pháp chuyển gen qua ống phấn
lần đầu tiên được báo cáo thành công trên cấy bông [131]. Kỹ thuật này sau đó được sử dụng để chuyển gen ở một số cây trồng như: ngô [30], bông [90], lúa [40], [93], đậu tương [62], [128], lúa mì [123], [130], dưa hấu [26]. Một số báo cáo đã chỉ ra rằng có thể chuyển gen vào đậu tương thông qua ống phấn [61], [79], [80]. Moore và cộng sự (1996) đã sử dụng phương pháp này để tạo ra cây đậu tương và cây bông chuyển gen. Nhóm tác giả đã thu được 50 hạt đậu tương, 226 hạt bông. Nhưng tất cả đều cho kết quả âm tính khi sử lý thuốc diệt cỏ. Zenglu Li và cộng sự (2001) [128] đã thu được xấp xỉ 5000 hạt đậu tương sau khi sử lý hoa với DNA mang gen bar. Khi kiểm tra tất cả các hạt thu được từ cây xử lý với DNA có chứa gen bar đều không cho kết quả dương tính với gen này. Quan sát hình thái của một vài cây thấy có sự khác nhau, nhưng hạt của chúng không có khả năng nảy mầm. Thí nghiệm khác với gen gus, nhóm tác giả thu được gần 2% số hạt của các cây được xử lý với DNA có chứa gen
gus phản ứng dương tính với gen này khi kiểm tra. Tuy nhiên, khi cho hạt nảy mầm và tiến hành lấy lá phân tích thì không thấy có sự hoạt động của gen gus. 3% hạt thu từ các cây thế hệ sau được kiểm tra đều không thấy có biểu hiện của gus. Huixia Shou và cộng sự (2002) [62] đã tiến hành chuyển gen vào 8 giống đậu tương, trong đó có giống mô hình Williams 82 bằng kỹ thuật chuyển gen qua ống phấn dựa trên phương pháp của Liu và cộng sự (1992) [79]. Tuy nhiên kết quả đã không thành công như mong muốn. Nhiều báo cáo trước đây khi sử dụng phương pháp chuyển gen này cũng đều chỉ ra những hạn chế của phương pháp [61], [131].
Những nghiên cứu cải tiến quy trình chuyển gen ở đậu tƣơng
P.M. Olholf và Somers (2001) [95] đã gia tăng khả năng lây nhiễm vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens vào vùng nốt lá mầm đậu tương từ 37% lên 91%bằng cách
bổ sung L-Cysteine vào môi trường lây nhiễm. Điều này cho thấy sự chuyển nạp bền
vững T-DNA vào chồi tăng gấp 5 lần so với môi trường không có L-Cysteine. Hiện
tượng hóa nâu tại những vết thương sau khi lây nhiễm với vi khuẩn giảm, khả năng
phục hồi của mẫu cấy tăng lên. Qua phân tích Southern, số cây chuyển gen cho kết quả
lai tăng gấp 2 lần so với biến nạp gen thông thường. Đồng thời, hiệu quả chuyển nạp
gen tăng từ 0,7-16,4% khi xử lý với tác nhân chọn lọc bằng hygromycin B.
Olhoft và cộng sự (2003) [91] cải tiến phương pháp chuyển nạp gen vào nốt lá mầm cho hiệu quả chuyển nạp cao hơn bằng sử dụng chất chọn lọc hygromycin để lựa chọn các cá thể chuyển gen. Những dòng đậu tương sử dụng chuyển nạp gen được lây nhiễm với chủng vi khuẩn A.tumefaciens LBA4404 hoặc EHA105 mang plasmid pGPTV, pTOK233, pCAMBIA1305 hoặc pCAMBIA1309 và tái sinh trên môi trường có hoặc không có sự hiện diện của bạc nitrat (AgNO3). Phân tích cây T0 cho thấy số đoạn gen hpt trên mỗi cây từ 1-15 đoạn, trong đó 31,5% dòng có một đoạn gen hpt. Phân tích Southern 270 cây T0 và 95 cây T1 cho thấy sự gắn kết T-DNA vào tế bào chủ rất ổn định.
Gần đây, phương pháp chuyển nạp gen bằng A.tumefaciens cho đậu tương được cải tiến và cho hiệu quả cao hơn gồm việc thiết lập nuôi cấy invitro, tạo chồi và tái sinh chồi. Hạt đậu tương ngâm trong 24 giờ sau đó chọn đỉnh phôi và cấy trên môi trường B5 bổ sung 3,5 mg/l BAP để khoảng 24 giờ rồi chuyển đến môi trường MS B5 + 0,2 mg/l BAP và 0,2 mg/l indole butylic acid (IBA). Sử dụng đỉnh phôi có tần số tái sinh cao hơn (87,7%) so với nốt lá mầm (40,3%) và trụ hạ diệp (56,4%). Đỉnh phôi được lây nhiễm với EHA 105 mang plasmid pCAMBIA2301 và nuôi cấy khoảng 24giờ, kết quả cho thấy hiệu quả A. tumefaciens chuyển T-DNA lên đến 78,2%. Thêm vào đó, sử dụng antioxidant làm tăng khả năng lây nhiễm của vi khuẩn A. tumefaciens
cho đậu tương [50]. Margine M. Paz và cộng sự (2006) [85] sử dụng nửa hạt (haft- seed) từ hạt đậu tương cho hút ẩm qua đêm và so sánh với phương pháp sử dụng nốt lá mầm của cây mầm in vitro 5-7 ngày tuổi. Kết quả, cho thấy tỷ lệ chuyển gen nửa hạt là 1,4-8,7% trong đó có 3,8% cây chuyển gen T1 sống trên môi trường chọn lọc bằng glyfosinate. Hiệu quả này cao cấp 1,5 lần phương pháp sử dụng nốt lá mầm khi thực hiện nuôi cấy in vitro. Hệ thống chuyển nạp gen này đơn giản và không cần thao tác nuôi cấy mô phức tạp so với chuyển gen thông thường trên nốt lá mầm.
Nghiên cứu tạo cây trồng chuyển gen an toàn sinh học
Sử dụng gen chỉ thị rất cần thiết để lựa chọn tế bào chuyển gen. Tuy nhiên, việc tìm kiếm gen chỉ thị có khả năng sàng lọc rộng rãi ở thực vật là một yêu cầu ngày càng lớn. Cây chuyển gen không thể sử dụng một gen chỉ thị để nhận biết nhiều gen cùng
một lúc. Quá trình giao phấn (lai tạo) sẽ làm cho sự biểu hiện của gen ngày càng phức tạp bởi vì sự dư thừa gen chuyển trong hệ genome có thể gây ra các gen khác bị câm lặng. Nhiều lo ngại về an toàn sinh học hay sức khỏe của người sử dụng đang là trở ngại để phát triển cây trồng chuyển gen. Gen chỉ thị chọn lọc hiện tại trong các cây trồng biến đổi gen xuất hiện những đặc tính không mong muốn mặc dù các gen chỉ thị này được xem như không có hại cho các sinh vật khác [52]. Thêm nữa, có những lo ngại cho rằng các gen chỉ thị có khả năng chuyển vào cỏ dại hoặc là nguồn vi sinh vật
