3. Yêu cầu nghiên cứu
3.4.6.Ảnh hưởng của hygromycin đến khả năng chọn lọc sau chuyển gen
Bảng 3.9. Ảnh hƣởng của hygromycin đến khả năng chọn lọc sau chuyển gen sau 28 ngày Nồng độ hygromycin (mg/l) Tổng số chồi chọn lọc Số chồi sống sót Tỷ lệ (%) 0 90 90 100 5 90 8 8,89 10 90 6 6,67 15 90 4 4,44 20 90 3 3,33 25 90 1 1,11
Khả năng tái sinh sau chuyển gen ở đậu tương bằng nốt lá mầm thường tạo ra một số lượng lớn chồi hình thành. Tuy nhiên không phải tất cả các cá thể đã được chuyển gen. Bằng thực nghiệm nhiều nhà khoa học đã chỉ ra hiệu quả biến nạp gen ở đậu tương không cao (khoảng 1-3%) [8], [126]. Hệ thống chọn lọc ở đậu tương đã sử dụng gen chọn lọc như (neomycin 3`-O-phosphotransferase (nptII), phosphinothricin acetyltransferase (bar), 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (epsps), các hợp chất có tính chọn lọc trội kanamycin [58], glufosinate [phosphinothricin (PPT) [127], glyphosate [N-(phosphonom-ethyl) glycine [114], hygromycin [91]. Khi sử dụng các tác nhân chọn lọc đã loại bỏ được tỷ lệ lớn các cây không chuyển gen [58] và cây khảm [37]. Olhoft và Somers (2001) đã sử dụng chất PPT để chọn lọc chồi chuyển gen của cây đậu tương theo phương pháp nốt lá mầm. Kết quả có tới 90-95% số chồi không chuyển gen bị loại bỏ, tỷ lệ cây sống sót sau chọn lọc chỉ đạt 2,1% [95].
Trong thí nghiệm, sử dụng hygromycin ở các nồng độ khác nhau (5, 10, 15, 20, 25mg/l) để loại bỏ chồi không được chuyển nạp gen. Kết quả sau 28 ngày chọn lọc tỷ lệ chồi có khả năng không được chuyển gen bị loại bỏ tăng dần theo nồng độ hygromycin (bảng 3.9 và hình 3.6). Trên môi trường không bổ sung hygromycin
(hygromycin - 0mg) tất cả các chồi đều sống sót (100%). Khi bổ sung hygromycin vào môi trường, tỷ lệ chồi sống sót giảm đi đáng kể (dao động từ 1,11 đến 8,89%). Nồng độ hygromycin trong môi trường càng cao số chồi sống sót càng giảm (bảng 3.9 ). Hiệu quả chọn lọc các tế bào chuyển gen phụ thuộc vào nhiều yếu tố như kích thước mẫu chọn lọc; đặc tính, nồng độ của hóa chất chọn lọc; số lần chọn lọc [101]. So sánh với các kết quả nghiên cứu trước đây chúng tôi nhận thấy ở nồng độ hygromycin 20mg/l là phù hợp cho chọn lọc chồi sau chuyển gen của giống đậu tương ĐVN9.
Hình 3.6. Chọn lọc chồi chuyển gen trên môi trường SIM có bổ sung hygromycin
A: Đối chứng trên môi trường hygromycin 0mg/l; B: hygromycin 10mg/l; C: hygromycin 20 mg/l; D: hygromycin 25mg/l.
A B