3. Yêu cầu nghiên cứu
3.4.5.Ảnh hưởng của L-cystein đến khả năng biến nạp
Để xác định ảnh hưởng của L-Cystein đến hiệu quả chuyển T-DNA vào nốt lá mầm đậu tương. Nốt lá mầm được gây tổn thương và lây nhiễm với chủng vi khuẩn AGL-1 sau đó đồng nuôi cấy 5 ngày trên môi trường bổ sung L-cystein ở các nồng độ khác nhau (0, 100, 200, 300, 400, 500mg/l). Sau thời gian đồng nuôi cấy, chồi được kiểm tra biểu hiện của gen gfp để đánh giá hiệu quả biến nạp. Kết quả ở bảng 3.8 cho thấy, khi bổ sung L-cystein từ 100-500mg/l vào môi trường đồng nuôi cấy hiệu quả biến nạp gen tăng lên đáng kể, dao động từ 1,85 đến 3,62%. Hiệu quả biến nạp gen cao nhất (3,62%) khi bổ sung 400mg L-cystein. Bổ sung L-cystein ở nồng độ cao hoặc thấp hơn 400mg/l đều làm giảm hiệu quả biến nạp.
Bảng 3.8. Ảnh hƣởng của L-cystein đến hiệu quả biến nạp gen Nồng độ L-cystein (mg/l) Tổng số chồi quan sát
Số chồi biểu hiện
gfp
Hiệu quả biến nạp (%) 0 214 3 1,40 100 216 4 1,85 200 209 5 2,39 300 218 6 2,75 400 221 8 3,62 500 211 4 1,90
Giới hạn chính trong chuyển gen vào nốt lá mầm đậu tương bằng vi khuẩn
Agrobacterium là tỷ lệ chuyển T-DNA từ vi khuẩn vào nốt lá mầm rất thấp. Gần đây, phương pháp tạo cây đậu tương chuyển gen bằng nốt lá mầm thông qua vi khuẩn
Agrobacterium đã được cải tiến bằng cách bổ sung L-cystein vào môi trường đồng nuôi cấy. P.M.Olhoft và D.A.Somers (2001) [95] đã làm tăng khả năng lây nhiễm của vi khuẩn Agrobacterium từ 37% lên 91% khi bổ sung L-cystein 600mg vào một lít môi trường đồng nuôi cấy thông qua biểu hiện tạm thời của gen GUS. Kết quả, T-DNA được chuyển bền vững vào nốt lá mầm đậu tương tăng gấp 5 lần. Phân tích Southern blot cho thấy hiệu quả biến nạp gen tăng gấp đôi so với không bổ sung L-cystein. Thêm nữa, hiện tượng thâm nâu và hoại tử tại những vết gây tổn thương trên mảnh lá mầm được loại bỏ. Điều này chứng tỏ có thể L-cystein đã tương tác với vết thương của tế bào thực vật, vi sinh vật và làm tăng sức sống của mẫu cấy. Do đó làm tăng khả năng chuyển T-DNA vào các tế bào nốt lá mầm của đậu tương. Kết quả thí nghiệm trên cây nho (Vitis vinifera L.) trước đây cũng tương tự khi kết hợp L-cystein với dithiothreitol hay polyvinylpolypyrrolidone (PVP) vào môi trường đồng nuôi cấy [104].