3. Yêu cầu nghiên cứu
2.3.7. Phƣơng pháp biến nạp gen vào các giống đậu tƣơng
Quy trình biến nạp dựa trên quy trình tái sinh cây (mục 2.2.5). Giống đậu tương được lựa chọn làm vật liệu để thực hiện chuyển gen được tiến hành theo quy trình sau:
Hình 2.3. Sơ đồ quy trình biến nạp gen vào đậu tương
Chuẩn bị vi khuẩn biến nạp
Chủng vi khuẩn AGL-1 được biến nạp plasmid vector pX2-H mang gen chọn lọc
hpt và gen chỉ thị gfp. Trước khi biến nạp, chủng vi khuẩn A. tumefaciens được lấy từ đĩa môi trường LB đặc nuôi trên môi trường LB lỏng có bổ sung 50mg hygromycin/l. Nuôi lắc qua đêm ở 280C (lắc 200 vòng/phút). Mật độ vi khuẩn được xác định bằng máy quang phổ khả kiến DUR
-800 (hãng BECKMAN COULTER) ở bước sóng 600nm (OD600). Ly tâm dịch khuẩn ở 10.000 vòng/phút trong 10 phút để thu cặn tế bào. Cặn tế bào được làm loãng trong dung dịch CCM lỏng (bảng 2.1), nuôi lắc 200 vòng/phút ở 280C khoảng 40-60 phút trước khi biến nạp.
Hạt đậu tương Khử trùng bề mặt Nảy mầm trên GM
Nuôi lỏng tạo huyền phù
Gây tổn thương nách lá mầm trong dịch khuẩn lây nhiễm 60 phút
Đồng nuôi cấy trên CCM ở điều kiện tối Cảm ứng tạo chồi trên SIM
Cắt bỏ lá mầm, chuyển sang môi trường kéo dài chồi SEM
Ra rễ trên RM 3-5 ngày 5 ngày 4 tuần Ra cây Chủng vi khuẩn A. tumefaciens
Chuẩn bị mẫu đậu tƣơng cho biến nạp và biến nạp
- Tạo vật liệu biến nạp và lây nhiễm
Phương pháp tạo vật liệu cho biến nạp (nốt lá mầm) được tiến hành tương tự mục (2.2.5).
Sau khi gây tổn thương, mẫu nuôi cấy được đưa vào lây nhiễm trong dung dịch chứa vi khuẩn A. tumefaciens trong 60 phút, lắc nhẹ 70-80 vòng/phút. Nuôi cấy mẫu trên môi trường đồng nuôi cấy (CCM-bảng 2.1) 5 ngày trong tối ở 250
C.
- Chọn lọc và tái sinh
Sau 5 ngày đồng nuôi cấy, mẫu lây nhiễm được rửa trong dung dịch SIM lỏng có bổ sung cefotaxim 200mg/l (bảng 2.1). Mẫu lây nhiễm được nuôi cấy tái sinh trên môi trường SIM đặc không bổ sung hygromycin để tái sinh chồi. Giai đoạn tái sinh chồi lần thứ nhất khoảng 10-14 ngày trên môi trường không bổ sung hygromycin trong điều kiện chiếu sáng 18h/ngày, nhiệt độ 250C. Sau khi có chồi xuất hiện, tiến hành cắt bỏ toàn bộ phần lá mầm, chuyển chồi hình thành sang môi trường SIM mới có bổ sung hygromycin (nồng độ theo công thức thí nghiệm) để chọn lọc chồi chuyển gen. Thời gian chọn lọc khoảng 14 ngày ở 250
C, chiếu sáng 18h/ngày. Lựa chọn chồi sống sót sau 14 ngày chọn lọc chuyển sang môi trường SEM để kéo dài chồi.
- Các giai đoạn tiếp theo (kéo dài chồi, tạo rễ và đưa cây ra trồng) tiến hành tương tự mục 2.2.5
Bảng 2.1. Thành phần môi trƣờng nuôi cấy Thành phần Môi trƣờng nẩy mầm (GM) Môi trƣờng lây nhiễm (CCM) Môi trƣờng tạo chồi (SIM) Môi trƣờng kéo dài lóng (SEM) Môi trƣờng tạo rễ (RM)
MS đa lượng, vi lượng x x x x x
B5 vitamins x x x x x MES* - 3,9g/l 0,59g/l 0,59g/l 0,59g/l Sucrose 3% 3% 3% 3% 3% Agar 0,7% 0,7% 0,7% 0,7% 0,7% pH 5,6-5,8 5,6-5,8 5,6-5,8 5,6-5,8 5,6-5,8 6-benzyl- aminopurine - 1,5 mg/l 1,5 mg/l - - Gibberrellic acid - - - 1,5 mg/l -
L-Cysteine* - x - - -
Acetosyringone* - x - - -
Cefotaxim* - - 200 mg/l 200 mg/l -
Indole-3-butyric acid - - - - 1 mg/l
hygromicin* - - x x -
Ghi chú: (*) chỉ bổ sung vào môi trường chuyển gen
