3. Yêu cầu nghiên cứu
2.3.3. Phƣơng pháp tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn
DNA plasmid được tách theo phương pháp của Sambrook và cs.
Tế bào chứa plasmid cần tách chiết sẽ được nuôi cấy và để nhân lên đến giai đoạn cuối pha log (sau thời gian khoảng 14-16h). Tế bào sau đó được phá vỡ bằng kiềm và các chất tẩy rửa mạnh trong dung dịch I (Tris HCl 25mM, pH 8,0; EDTA 10mM) và II (NaOH 0,2M; SDS 1%). DNA nhiễm sắc thể và protein trong tế bào được loại ra nhờ dung dịch III (CH3COOH). DNA plasmid dược kết tủa bằng cồn và thu lại nhờ ly tâm với tốc độ 12000 vòng/phút.
Quy trình: Nhân vi khuẩn qua đêm trong ống nghiệm chứa 2ml môi trường LB lỏng có kháng sinh thích hợp ở 37oC trên máy lắc; Thu tế bào vi khuẩn từ dịch nuôi bằng ly tâm 6000vòng/phút trong 6 phút. Bỏ dịch, thu cặn tế bào. Bổ sung 150µl dung dịch I vortex mạnh; bổ sung 150µl dung dịch II, đảo nhẹ; bổ sung 150 µl dung dịch III tiếp ngay sau đó, rồi để trong lạnh khoảng 5 phút. Ly tâm 12000vòng/phút trong 15 phút ở 4oC, thu dịch. Bổ sung 1ml cồn 100% để tủ lạnh -20oC trong 3h để tủa DNA. Ly tâm 12000vòng/phút trong 15 phút ở 4oC. Bỏ dịch, thu tủa DNA; thêm 500 µl dung dịch chloroform: isoamyl acohol (tỉ lệ thể tích 24:1), đảo đều hỗn hợp. Ly tâm 12000vòng/phút trong 15 phút ở 4oC, chiết và truyền pha lỏng ở phía trên sang một
ống eppendorf sạch. Thêm 50 µl CH3COONa 3M ( pH 5,2) và 1ml cồn 100%, đảo đều và giữ lạnh ở -20oC trong 3h. Ly tâm 12000vòng/phút trong 15 phút ở 4oC để thu tủa DNA. Đổ bỏ cồn làm khô bằng máy SpeedVac trong 5 phút. Hòa tan tủa DNA trong 50µl nước chứa ARase (0.01mg/ml). Bảo quản DNA ở -20o
C - Kiểm tra DNA trên gel agarose 1,0%