3. Yêu cầu nghiên cứu
2.3.9.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm
1. Đánh giá khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh của một số giống đậu tương nghiên cứu, lựa chọn giống làm vật liệu cho thí nghiệm chuyển gen
Thí nghiệm tiến hành đánh giá khả năng tái sinh cây của 13 giống đậu tương của Việt Nam. Mỗi giống tiến hành nuôi cấy 100 mảnh lá mầm trên môi trường tái sinh SIM đã được chuẩn bị sẵn (bảng 2.1). Mỗi đĩa petri nuôi cấy 5 mẫu. Chồi được kéo dài trên môi trường SEM và tạo rễ trên môi trường GM. Thí nghiệm tiến hành nhắc lại 3 lần.
2. Tối ưu hóa một số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả chuyển gen ở một số giống đậu tương nghiên cứu
2.1. Lựa chọn chủng vi khuẩn thích hợp
Sử dụng 5 chủng vi khuẩn bao gồm EHA105, C58, LBA4404, GV3101, AGL-1 chứa vector nhị thể pCAMBIA1301 mang gen chỉ thi GUS để biến nạp vào một trong 13 giống đậu tương được lựa chọn ở mục 1. Hiệu quả biến nạp gen được đánh giá thông qua biểu hiện tạm thời của gen GUS. Phương pháp nhuộm GUS được tiến hành theo Jefferson và cộng sự (1987) [64]. Chủng vi khuẩn được chọn lọc ở sẽ sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo
2.2. Ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn đến hiệu quả biến nạp
Hệ thống vector pX2-H::GFP được biến nạp vào chủng vi khuẩn thích hợp và được sử dụng cho thí nghiệm. Nuôi lắc chủng vi khuẩn trên môi trường LB lỏng có kháng sinh thích hợp và xác định nồng độ (OD600) bằng máy đo quang phổ kế. Thí nghiệm tiến hành ở các nồng độ OD: 0, 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0; 1,2; 1,4. Nồng độ OD thích hợp được xác định bằng hiệu quả biểu hiện của gen gfp
2.3. Ảnh hưởng của phương thức tăng cường hiệu quả biến nạp
Thí nghiệm tiến hành đánh giá hiệu quả của việc kết hợp giữa lây nhiễm với lắc mẫu trong dịch khuẩn ở tốc độ khác nhau: 0 vòng, 60v/p, 70v/p, 80v/p, 90v/p, 100v/p. Phương thức thích hợp được xác định bằng hiệu quả biểu hiện của gen gfp
2.4. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả biến nạp
Tiến hành thử nghiệm đồng nuôi cấy mẫu trên môi trường cộng sinh của vi khuẩn ở các thời gian: 0 ngày, 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày, 10 ngày. Thời gian đồng nuôi cấy thích hợp được xác định bằng hiệu quả biểu hiện của gen gfp
2.5. Ảnh hưởng của nồng độ chất dẫn dụ Acetosyringon (AS) đến hiệu quả biến nạp gen.
Đánh giá ảnh hưởng của chất AS ở các nồng độ 0 mg/l; 50mg/l; 100mg/l; 150mg/l; 200mg/l; 250mg/l. Nồng độ AS thích hợp được xác định bằng hiệu quả biểu hiện của gen gfp
2.6. Ảnh hưởng của L-cystein đến hiệu quả biến nạp gen
Thử nghiệm ảnh hưởng của L-cystein ở các nồng độ 0 mg/l; 100mg/l; 200mg/l; 300mg/l; 400mg/l; 500mg/l. Nồng độ L-cystein thích hợp được xác định bằng hiệu quả biểu hiện của gen gfp
2.7. Ảnh hưởng của hygromycin đến hiệu quả chọn lọc sau chuyển gen
Đánh giá ảnh hưởng của hygromycin ở các nồng độ 0, 5, 10, 15, 20, 25mg/l. Nồng độ hygomycin thích hợp được xác định bằng tỷ lệ chọn lọc cá thể chuyển gen
3. Đánh giá hiệu quả biến nạp gen ở một số giống đậu tương chọn lọc
Thực hiện các thí nghiệm chuyển gen đồng loạt dựa trên các yếu tố tối ưu ở mục 2 vào một số giống đậu tương chọn lọc. Hiệu quả biến nạp được xác định thông qua biểu hiện của gen gfp.
4. Phân tích các dòng đậu tương chuyển gen sau khi chọn lọc sau bằng PCR Các dòng đậu tương sau chọn lọc được tách DNA tổng số và phân tích PCR theo quy trình được trình bày ở mục 2.7.2