3. Yêu cầu nghiên cứu
3.4.3.Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả biến nạp gen
Trong thí nghiệm này để xác định ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả biến nạp gen ở đậu tương, chúng tôi bố trí 5 công thức thí nghiệm sử dụng chủng vi khuẩn AGL-1 có OD600= 0,8-1,0 với thời gian đồng nuôi cấy lần lượt là: 0, 3, 5, 7, 10 ngày nuôi trong tối. Kết quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 3.6.
Kết quả thí nghiệm cho thấy: thời gian đồng nuôi cấy ảnh hưởng rõ rệt đến tỷ lệ mẫu sống và hiệu quả biến nạp gen. Mẫu biến nạp hầu như không bị ảnh hưởng sau đồng nuôi cấy từ 0-3 ngày (tỷ lệ mẫu sống 100%). Hiệu quả biến nạp đạt 1,75% sau 3 ngày đồng nuôi cấy. Khi kéo dài thời gian đồng nuôi cấy lên 5 ngày mẫu biến nạp có biểu hiện bị chết do ảnh hưởng của vi khuẩn (tỷ lệ mẫu sống đạt 98%). Tuy nhiên, hiệu quả biến nạp được nâng lên 1,89%. Tiếp tục kéo dài thời gian đồng nuôi cấy lên 7-10 ngày, tỷ lệ mẫu sống giảm xuống đáng kể, lần lượt đạt 82 và 31%. Do mẫu bị tổn thương quá lớn trong quá trình đồng nuôi cấy với vi khuẩn nên không còn khả năng phục hồi để tái sinh chồi. Tỷ lệ mẫu chết tăng làm giảm đáng kể hiệu quả biến nạp gen (1,44 và 1,02%). Nếu thời gian đồng nuôi cấy 0 ngày (không đồng nuôi cấy), vi khuẩn không đủ thời gian xâm nhiễm vào vật chủ do đó không thực hiện được quá trình truyền T-DNA (biến nạp). Do vậy, thời gian đồng nuôi cấy được lựa chọn là từ 3-5 ngày là phù hợp khi biến ở đậu tương.
Margie M. Paz và cộng sự (2004) [101] khi xác định các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chuyển gen vào nốt lá mầm đậu tương thông qua vi khuẩn A.tumefaciens đã tiến hành đồng nuôi cấy từ 3-5 ngày, trong điều kiện tối hoặc ngoài ánh sang ở 240
C đều cho kết quả tương tự. Liu S.J. và cộng sự (2008) [80] cũng tiến hành đồng nuôi cấy 5 ngày trong điều kiện tối đối với các giống đậu tương Trung Quốc. Kết quả này
còn được rất nhiều tác giả khác khẳng định trong báo cáo của mình [93], [117], [118], Thời gian đồng nuôi cấy thích hợp nhất đối với giống đậu tương là 3-5 ngày.
Bảng 3.6. Ảnh hƣởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả biến nạp gen Thời gian đồng nuôi cấy (ngày) Số mẫu biến nạp Tỷ lệ mẫu sống (%) Số chồi quan sát Số chồi biểu hiện GFP Hiệu quả biến nạp (%) 0 100 100 321 0 0 3 100 100 342 6 1,75 5 100 98 317 6 1,89 7 100 82 278 4 1,44 10 100 31 98 1 1,02