3. Yêu cầu nghiên cứu
3.4.1.Ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn lây nhiễm
Một trong những yếu tố ảnh hưởng rất lớn đến hiệu quả biến nạp gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium chính là mật độ của vi khuẩn khi lây nhiễm. Mật độ vi khuẩn thể hiện số tế bào vi khuẩn trong một đơn vị thể tích, khi lượng tế bào vi khuẩn quá thấp sẽ làm giảm tần số tiếp xúc với các mẫu thực vật do đó hiệu quả biến nạp không cao; ngược lại, khi lượng tế bào vi khuẩn quá cao ảnh hưởng tới sự phát triển của mẫu thực vật, thậm chí làm chết mẫu trong quá trình nuôi cấy. Mục đích của nghiên cứu này là xác định mật độ vi khuẩn (OD600) thích hợp cho quá trình biến nạp để sự xâm nhiễm của vi khuẩn Agrobacterium đạt hiệu quả nhất.
Thí nghiệm tiến hành thử nghiệm các nồng độ vi khuẩn khác nhau: OD600= 0,0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0; 1,2; 1,4 của chủng vi khuẩn AGL-1. Tổng số mẫu lây nhiễm tương ứng với mỗi công thức là 100 mảnh lá mầm của giống đậu tương ĐVN9. Kết quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 3.4.
Kết quả cho thấy: Mật độ vi khuẩn ảnh hưởng rõ rệt đến tần số chuyển gen cũng như tỷ lệ sống của mẫu. Ở nồng độ OD thấp hơn 0,6 (từ 0 đến 0,4) tỷ lệ mẫu sống sau giai đoạn đồng nuôi cấy đạt 100%, mẫu biến nạp hầu như không bị ảnh hưởng bởi nồng độ dịch khuẩn. Tuy nhiên, ở nồng độ này tỷ lệ mẫu biến nạp tương đồi thấp (0,56-0,6% với OD=0,2-0,4). Khi nồng độ dịch khuẩn đạt từ trên 0,6, với thời gian đồng nuôi cấy 5 ngày, mẫu có biểu hiện bị chết do mật độ khuẩn dày đặc. Tỷ lệ mẫu chết tăng đáng kể khi mật độ vi khuẩn đạt trên 1,0 (tỷ lệ mẫu sống giảm từ 84% ở OD=1,0 xuống 62% khi OD=1,4). Về hiệu quả biến nạp, ở khoảng nồng độ OD = 0,2-1,0 hiệu quả biến nạp có dấu hiệu tăng dần từ 0,56 đến 1,89%. Trong đó, với khoảng nồng độ từ 0,8-1,0 cho hiệu quả biến nạp mẫu cao hơn ở các nồng độ khác, lần lượt đạt 1,86 và 1,89%. Khi mật độ vi khuẩn đạt 1,2 và 1,4, tỷ lệ mẫu chết tương đối cao (67 và 62%) do đó đã ảnh hưởng lớn đến hiệu quả biến nạp gen (hiệu quả biến nạp gen đạt 0,94 và 0,50%).
Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của mật độ vi khuẩn biến nạp đến hiệu quả biến nạp gen
OD600 Số mẫu biến nạp Tỷ lệ mẫu sống (%) Số chồi quan sát Số chồi biểu hiện GFP
Hiệu quả biến nạp
(%) 0,0 100 100 325 0 0 0,2 100 100 357 2 0,56 0,4 100 100 331 2 0,60 0,6 100 98 287 3 1,05 0,8 100 97 269 5 1,86 1,0 100 84 264 5 1,89 1,2 100 67 213 2 0,94 1,4 100 62 201 1 0,50
C. A. Meurer và cộng sự (1998) [21] đã sử dụng chủng vi khuẩn EHA105 với mật độ OD=1,0 để lây nhiễm với nốt lá mầm của 28 giống đậu tương khác nhau cho kết quả cao. P. M. Olhoft và D. A. Somers (2001) [95], Olhoft và công sự (2003) [91] đã sử dụng nồng độ dịch khuẩn OD600 = 0,8-1,0 khi tiến hành lây nhiễm với nốt lá mầm đậu tương và thu được tần số biểu hiện tạm thời của gen GUS lên đến 83,3%. Các kết quả nghiên cứu khác cũng cho kết quả tương tự [8], [89], [101], [102]. Như vậy, từ kết quả thí nghiệm trên có thể sử dụng giá trị OD dao động từ 0,8 – 1,0 khi biến nạp vi khuẩn với giống đậu tương ĐVN9.