3. Yêu cầu nghiên cứu
3.1.2. Khả năng kéo dài chồi, ra rễ tạo cây hoàn chỉnh của các giống đậu tương
đa chồi phụ thuộc rất nhiều vào giống. Điều này hoàn toàn trùng lặp với các nghiên cứu trước đây của một số tác giả [7], [122].
Hình 3.1. Phát sinh tạo đa chồi ở một số giống đậu tương nghiên cứu
3.1.2. Khả năng kéo dài chồi, ra rễ tạo cây hoàn chỉnh của các giống đậu tương nghiên cứu nghiên cứu
Kéo dài chồi và ra rễ là kỹ thuật nuôi cấy tiếp sau giai đoạn biến nạp và tái sinh chồi chuyển gen. Ở thí nghiệm không chuyển gen, nốt lá mầm sau khi tái sinh chồi trên môi trường SIM tiến hành cắt bỏ phần lá mầm. Chồi mầm có chiều dài khoảng 0,7-1cm được cấy chuyển sang môi trường SEM có bổ sung GA3 1,5mg/l. Sau 4 tuần nuôi cấy, chiều dài chồi trung bình của các giống đậu tương nghiên cứu đều trên 5cm, dao động từ 5,0 đến 6,6cm (ngoại trừ giống DT2003 có chiều dài chồi 4,3cm) (bảng 3.2).
DT84 DT2003 DT2001
Toàn bộ chồi mầm có chiều dài trên 4cm được cắt và cấy chuyển sang môi trường GM để kích thích tạo rễ. Sau 3 tuần nuôi cấy, tỷ lệ tạo rễ của các giống tương đối cao, dao động từ 79,4 đến 99,7%. Chiều dài rễ dao động từ 5,2 đến 7,7cm. Trong đó, các giống D9602, ĐT22 , D2101, DT2001, DT96 có tỷ lệ ra rễ dao động từ 79,4 đến 87,3%. Các giống còn lại có tỷ lệ ra rễ cao hơn, dao động từ 90,3 đến 99,7%.
Bảng 3.2. Khả năng kéo dài chồi và ra rễ tạo cây hoàn chỉnh của một số giống đậu tƣơng nghiên cứu
STT Tên giống Số mẫu ban đầu (chồi)
Chiều dài chồi sau 4 tuần (cm) Tỷ lệ ra rễ sau 3 tuần (%) chiều dài rễ TB (cm) 1 ĐVN9 90 6,6 98,4 7,2 2 ĐVN10 90 5,8 97,3 7,0 3 ĐVN11 90 6,2 99,7 6,9 4 DT84 90 5,9 90,3 5,7 5 DT96 90 5,0 83,3 5,9 6 DT2001 90 6,2 87,3 5,8 7 DT2003 90 4,3 99,3 7,7 8 DT2008 90 5,1 97,3 6,8 9 ĐT22 90 5,6 82,3 5,7 10 ĐT26 90 5,2 97,5 6,8 11 D9602 90 6,0 79,4 5,8 12 D2101 90 5,6 85,8 5,2 13 VMK 90 5,6 98,2 6,6 CV (%) 4,8 5,4 3,2 LSD.05 2,34 7,15 1,87
Hình 3.2. Phát sinh rễ của một số giống đậu tương
A- DT84; B- ĐVN 9; C- DT2008
3.2. Kết quả lựa chọn chủng vi khuẩn thích hợp cho chuyển gen ở đậu tƣơng
Cây hai lá mầm được xem là vật chủ tự nhiên của Agrobacterium. Đến nay, phương pháp chuyển gen trên đối tượng này nhờ vi khuẩn A.tumefaciens được đánh giá là hiệu quả nhất và được thực hiện khá đơn giản với sự hỗ trợ của các chỉ thị chọn lọc. Nhưng đậu tương là cây rất khó tính đối với sự xâm nhập của vi khuẩn, cho tới nay người ta mới chỉ tìm ra một số chủng Agrobacterium mẫm cảm với đậu tương [58], [91], [121].
Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành các thí nghiệm lây nhiễm nốt lá mầm giống đậu tương ĐVN9 với 5 chủng vi khuẩn Agrobacterium: GV3101, LBA4404, C58, EHA105 và AGL-1 mang vector nhị thể pCAMBIA1301 chứa gen chỉ thị GUS với mục đích lựa chọn chủng vi khuẩn thích hợp cho biến nạp gen ở đậu tương. Kết quả thu được trình bày ở bảng 3.3
Bảng 3.3. Kết quả lựa chọn chủng vi khuẩn thích hợp cho biến nạp gen ở đậu tƣơng Chủng vi khuẩn Tổng số mẫu Số mẫu dƣơng tính Tần số biến nạp (%) Mức độ biểu hiện LB (đ/c) 150 0 0,0 - GV3101 150 6 4,0 ++ LBA4404 150 13 8,7 ++ C58 150 8 5,3 + EHA105 150 10 6,7 + AGL-1 150 17 11,3 +++ A B C
Ghi chú: (+++) Biểu hiện tốt: mẫu có màu xanh chàm với vùng biểu hiện rộng
(++) Biểu hiện bình thường: mẫu có màu xanh chàm nhạt, vùng biểu hiện trung bình
(+) Biểu hiện kém: vùng biểu hiện là các đốm xanh rải rác (-): không biểu hiện
Hình 3.3. Biểu hiện gus ở đậu tương khi được lây nhiễm với các chủng vi khuẩn khác nhau
Ghi chú: a) Đối chứng (LB); b) Chủng GV3101; c) Chủng LBA4404; d) Chủng C58; e) Chủng EHA105; f) Chủng AGL-1
Kết quả thí nghiệm ở bảng 3.3 và hình 3.3 cho thấy sự biểu hiện của gen GUS
rất khác nhau sau khi lây nhiễm giống đậu tương ĐVN9 lần lượt với 5 chủng vi khuẩn
Agrobacterium là GV3101, LBA4404, C58, EHA105 và AGL-1. Mẫu đối chứng được biến nạp trong môi trường LB lỏng không chứa vi khuẩn, kết quả cho thấy không thu được mẫu có biểu hện GUS dương tính khi nhuộm với X-Gluc. Đối với chủng AGL-1, mẫu phát triển tốt, khỏe mạnh và tỷ lệ sống cao, tần số biểu hiện gen tạm thời đạt
a) b) c)
11,3%; vùng biểu hiện rộng (mức độ +++). Ở chủng LBA4404, GV3101 thu được các mẫu có tần số biến nạp lần lượt đạt 8,76% và 4,0%; mức độ biểu hiện kém hơn so với chủng AGL-1 (mức ++). Chủng C58 và EHA105 có tần số biến nạp lần lượt đạt 5,3 và 6,7%, cao hơn chủng GV3101. Tuy nhiên, mức độ biểu hiện thấp.
Các nghiên cứu trước đây đã đưa ra một số chủng Agrobacterium khác nhau có khả năng xâm nhiễm hiệu quả vào nốt lá mầm của các giống đậu tương. Năm 1989 Parrott và cộng sự lần đầu tiên sử dụng chủng vi khuẩn LBA4404 và EHA101 để biến nạp gen vào 15 giống đậu tương khác nhau [97]. Ông so sánh hiệu quả biến nạp và nhận thấy ở một số giống cho hiệu quả cao khi sử dụng chủng EHA101. Một số giống khác lại thích ứng với chủng LBA4404. Tiếp đến, Olhoft và cộng sự (2003) [91] cũng đã thành công khi biến nạp chủng LBA4404 mang vector nhị thể pTOK233 với nốt lá mầm giống đậu tương „Bert‟; Hai-Kun Liu và cộng sự (2004) [51] sử dụng chủng vi khuẩn EHA105 để biến nạp vào đỉnh phôi của các giống đậu tương Hefeng 35, Dongnong 42, và Hefeng 39 cho hiệu quả tương đối cao. Sau đó có nhiều nhà khoa học sử dụng chủng vi khuẩn này để biến nạp gen vào đậu tương [80], [121]. Tran Thi Cuc Hoa và cộng sự (2008) [118] cũng đã thu được cây chuyển gen tái sinh khi biến nạp chủng EHA101 mang vetor pZY102 vào nốt lá mầm giống đậu tương PC19. Nhưng cho tới nay hiệu quả biến nạp gen thông qua Agrobacterium ở đậu tương còn tương đối thấp, người ta vẫn chưa tìm ra được một chủng hay một vector nào thích hợp có thể sử dụng để biến nạp vào tất cả các giống đậu tương. Điều này phản ánh tính phức tạp trong mối tương tác giữa Agrobacterium và thực vật. Kết quả nghiên cứu bước đầu đã lựa chọn được chủng AGL-1 mang vector pCAMBIA1301 để lây nhiễm với giống đậu tương ĐVN9 cho hiệu quả biến nạp gen tạm thời tương đối cao. Chủng vi khuẩn AGL-1 được lựa chọn để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
3.3. Kết quả biến nạp plasmid vector pX2-H::gfp vào chủng vi khuẩn thích hợp để biến nạp vào đậu tƣơng
Vector pX2-H là một vector nhị thể mang 2 đoạn T-DNA. Đoạn T-DNA thứ nhất mang gen chỉ thị sàng lọc GFP và gen chọn lọc hygromycin. Đoạn T-DNA thứ hai có các trình tự nhận biết của các enzyme cắt giới hạn để có thể chèn các gen quan tâm (kháng sâu hoặc kháng hạn). Đặc điểm ưu việt c ủa vector này là khả năng phân tách các cá thể chuyển gen ở thế hệ thứ hai trở đi. Do vậy, có thể tạo ra cây đậu tương chuyển gen không mang gen kháng kháng sinh. Đảm bảo tính an toàn sinh học.
Qua thí nghiệm lựa chọn chủng vi khuẩn thích hợp cho chuyển gen ở đậu tương. Chủng AGL-1 được xác định là thích hợp với đậu tương hơn các chủng còn lại nên được lựa chọn để tiến hành cho các thí nghiệm kế tiếp.
Hệ thống plasmid vector pX2-H::gfp được biến nạp vào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens chủng AGL-1 bằng phương pháp xung điện. Sau khi điện xung, dịch khuẩn được nuôi cấy chọn lọc khuẩn lạc trên môi trường chứa hygromycin 50mg/l. Sau 48-72h nuôi cấy ở 280C, trên đĩa thạch xuất hiện các khuẩn lạc màu trắng, hình tròn. Lựa chọn mười khuẩn lạc dương tính trên môi trường chọn lọc, tách plasmid và kiểm tra bằng PCR với cặp mồi gfp. Kết quả biến nạp và chọn lọc được thể hiện ở hình 3.4 và 3.5.
Hình 3.5. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc với cặp mồi gfp
Ghi chú: M: Thang DNA chuẩn 1kb; 1: H2O không có DNA plasmid (mẫu âm tính); từ 2-11: Khuẩn lạc pX2-H::gfp
Kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy: trong 10 khuẩn lạc được kiểm tra có 2 khuẩn lạc (số 3 và số 11) không xuất hiện băng vạch trên bản điện di. Các khuẩn lạc còn lại đều xuất hiện băng vạch với kích thước (600bp) phù hợp với đoạn gen gfp
(hình 3.5). Những khuẩn lạc này được nuôi lỏng trên môi trường LB lỏng có bổ sung hygromycin 50mg/l để phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo.
