3. Yêu cầu nghiên cứu
2.3.8.2. Phân tích PCR
- Phương pháp tách chiết DNA tổng số:
DNA được tách chiết và tinh sạch bằng phương pháp CTAB của Saghai Maroof (1984) có cải tiến cho phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm
Hóa chất được sử dụng để tách chiết DNA như sau: 1) Đệm CTAB 100 ml gồm:
- CTAB (Cetyltrimethyl ammonium bromide) : 2,25 gam
- -Mercapto ethanol : 250 l
- EDTA (Ethylenediamine tetraacetate) : 4,5 ml
- NaCl 5M : 30 ml - Tris HCl 8,0 : 15 ml - H2O : 55 ml 2) Đệm TE EDTA pH 8,0 gồm: - Tris HCl 8,0 : 10 mM - EDTA 8,0 : 1 mM 3) Enzyme Rnase: 10 g/ml
4) Cồn tuyệt đối lạnh 5) NaCl 5 M
6) Dung dịch (24:1) gồm Chloroform/Isoamylalcohol pha theo tỷ lệ 24/1.
7) Dung dịch (25:24:1) gồm Phenol/Chloroform/Isoamylalcohol pha theo tỷ lệ 25/24/1.
8) Dung dịch rửa là cồn 75%.
Các bƣớc tiến hành :
1. Nghiền 0,3 - 0,5 gam lá đậu tương trong nitơ lỏng thành bột mịn.
2. Chuyển bột lá vào ống ly tâm 1,5 ml. Thêm 0,8 ml đệm CTAB đã ủ ở 650 C trong 10 phút.
3. Ủ các ống ly tâm ở 650
C trong 90 phút, lắc nhẹ nhàng nhưng dứt khoát 20 phút một lần để việc tách có hiệu quả.
4. Ly tâm 12.000 vòng/phút, hút lớp dịch nổi sang ống mới rồi bổ sung 0,7 ml dung dịch 24:1, lắc nhẹ nhàng trong 10 phút rồi tiến hành ly tâm trong 10 phút ở tốc độ 10.000 vòng/phút ở nhiệt độ phòng (lặp lại bước 4 2 lần).
5. Hút lớp dịch nổi sang ống mới rồi bổ sung (25:24:1) tỷ lệ (1:1) lắc nhẹ rồi 20 trong 20 phút. Rồi tiến hành ly tâm ở tốc độ 10.000 vòng/phút trong 10 phút.
6. Hút lớp dịch nổi sang ống mới bổ sung Isopropanol vào tỷ lệ 1:1 với mẫu, bổ sung thêm 3-5 l NaCl 5M. Lắc nhẹ trong 10 phút. Để trong tủ -200C qua đêm. 7. Ly tâm 14.000 vòng/phút trong 15 phút thu kết tủa.
8. Rửa với Ethanol 70% sau đó ly tâm 12.000 vòng/phút trong 20 phút (thực hiện 2 lần).
9. Loại bỏ dịch lỏng làm khô bằng máy ly tâm hút chân không (5 phút).
10.Bố sung 30 l H2O + 1 l RNAse sau đó ủ ở 370C trong 30 phút. Đem cất giữ ở -200
C.
