3. Yêu cầu nghiên cứu
3.5.1.Hiệu quả chuyển gen thông qua gen chỉ thị sàng lọc gfp
Trong thí nghiệm chúng tôi sử dụng gen chỉ thị gfp để sàng lọc các dòng đậu tương chuyển gen bền vững. Sau khi đồng nuôi cấy nốt lá mầm với vi khuẩn 5 ngày, toàn bộ mẫu được cấy chuyển sang môi trường tái sinh chồi không có chất chọn lọc hygromycin. Sau 10 ngày, cắt bỏ lá mầm, cấy chuyển cụm chồi sang đĩa môi trường mới và kiểm tra hiệu quả biến nạp thông qua biểu hiện của gen gfp dưới kính hiển vi huỳnh quang. Kết quả ở bảng 3.10 cho thấy, tổng số 2185 chồi của 5 giống đậu tương được kiểm tra chỉ có 53 chồi có sự biểu hiện của gen gfp, chiếm 2,43%. Hiệu quả biến nạp gen ở các giống có sự khác nhau rất rõ. Giống ĐVN9 và ĐT26 có hiệu quả biến nạp gen cao hơn các giống khác, lần lượt đạt 3,74 và 3,16%. Giống DT2008 có hiệu quả biến nạp gen thấp nhất (0,66%). Hai giống DT84 và DT96 cho hiệu quả biến nạp gen là 1,82 và 1,05%. Điều này cho thấy khả năng tiếp nhận gen của các giống đậu tương là khác nhau. Kết quả này cũng tương tự như các nghiên cứu trước đây: Xinping YI và Deyue YU (2006) [121] nghiên cứu chuyển gen trên 4 giống đậu tương của Trung Quốc cho hiệu quả chuyển gen từ 0,42% đến 2,26%. Margine M. Paz và cộng sự. (2006) [85] báo cáo hiệu quả chuyển nạp gen trung bình đạt 3,8% ở giống Thorne. Trần Thị Cúc Hòa (2008) [8] nghiên cứu chuyển nạp gen của các giống đậu tương MTĐ 176, HL 202, Maverick, Williams 82 và Bert bằng A. tumefaciens (pCambia 3301) cho hiệu quả trung bình 2,1% qua phân tích Southern blot.
Bảng 3.10. Hiệu quả chuyển gen vào một số giống đậu tƣơng thông qua vi khuẩn
A. tumefaciens
STT Tên giống Tổng số chồi kiểm tra Số chồi biểu hiện
gfp
Hiệu quả biến nạp
(%) 1 DT2008 301 2 0,66 2 DT84 439 8 1,82 3 ĐVN9 588 22 3,74 4 ĐT26 570 18 3,16 5 DT96 287 3 1,05 Tổng cộng 2185 53 2,43
GFP là gen chỉ thị sàng lọc có nhiều ưu điểm (1) có thể quan sát mẫu ở bất kỳ thời điểm nào mà không cần có sự kết hợp của cơ chất như gen chỉ thị GUS; (2) mẫu sau khi quan sát không bị ảnh hưởng hay loại bỏ; (3) biểu hiện của gen gfp luôn luôn bền vững. Gần đây nhiều nhà khoa học đã sử dụng chỉ thị gfp để sàng lọc cá thể chuyển gen và xem đó như là một chỉ thị bền vững trong chọn lọc ở các đối tượng như ngô [4], [15], đậu lima, Arabidopsis, lúa mì [74], lúa nước [22], đậu tương [121],…
pX2-H là hệ thống vector được Breitler J.C. và cộng sự (2003) [20] cải tiến và biến nạp vào lúa. Kết quả phân tích cho thấy ở thế hệ cây chuyển gen ban đầu (T0) có tới 82-90% cá thể mang gen quan tâm (gen bar) và gen kháng kháng sinh hygromycin được chuyển đồng thời vào cây. Tuy nhiên, ở thế hệ T1, tỷ lệ cây kháng thuốc diệt cỏ và hygromycin chỉ chiếm 14,3 và 17%. Phân tích các tính trạng hình thái của cây T0 cho thấy, gen chọn lọc hygromycin và gen kháng chất diệt cỏ nằm ở các vị trí không liên kết trên cùng locus nên bị phân tách ở thế hệ T1. Bằng phương pháp này cây lúa chuyển gen không mang gen kháng kháng sinh đã được tạo ra.
Kết quả thử nghiệm biến nạp hệ thống vector pX2-H mang gen sàng lọc vào một số giống đậu tương cho thấy khả năng hoạt động của chúng rất mạnh (hình 3.7). Do
vậy, có thể sử dụng cấu trúc vector này để chuyển các gen quan tâm vào đậu tương,