CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.2. CÔNG NGHỆ SINH KHỐI TẾ BÀO THỰC VẬT
1.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng tới sự phát triển tế bào và hàm lượng hoạt
1.2.3.1. Môi trường nuôi cấy
* Loại môi trường nuôi cấy
Thành phần môi trường là một trong hai nhóm yếu tố quyết định thành công của quá trình tạo sinh khối. Môi trường nuôi cấy phù hợp sẽ thúc đẩy tế bào phát triển. Đồng thời, môi trường cũng ảnh hưởng tới các quá trình sinh lý, sinh hóa của tế bào, làm tăng năng suất và hàm lượng hoạt chất. Các nhà khoa học đã thiết lập được một số môi trường nuôi cấy cơ bản với những thành phần và tỷ lệ muối vô cơ khác nhau [47]. Môi trường thường được sử dụng nhất trong nuôi cấy mô tế bào thực vật là Murashige - Skoog (MS). Bên cạnh đó còn có nhiều loại môi trường khác như B5, Nitsch, White... [46].
* Vai trò của một số yếu tố trong môi trường nuôi cấy - Nguồn hydratcarbon
Hydratcarbon là nguồn cung cấp toàn bộ năng lượng cho tế bào phát triển khi nuôi cấy trong điều kiện các tế bào đã bị tách li hoàn toàn ra khỏi cây.
Các đường thường được sử dụng là glucose, saccharose, maltose, fructose... , có thể sử dụng riêng lẻ hay kết hợp trong quá trình nuôi cấy [130].
Nồng độ và loại đường không những ảnh hưởng đến tốc độ phát triển của tế bào mà còn ảnh hưởng đến sinh tổng hợp các sản phẩm chuyển hóa thứ cấp. Vì khi nồng độ đường trong môi trường nuôi cấy làm tăng áp lực thẩm thấu và tác động vào tế bào thì nó kích thích làm tăng tổng hợp các phytoalexin [11], [102]. Kết quả nghiên cứu nuôi cấy tế bào Coleus blumei Benth. cho thấy khi dùng saccharose 7,5% trong môi trường nuôi cấy, thì hàm lượng hoạt chất là 3,3 g/l, nếu dùng saccharose 2,5% thì hàm lượng hoạt chất chỉ đạt 0,8% [94].
Vì vậy, trong thực nghiệm, phải tối ưu hóa loại và nồng độ đường nhằm đảm bảo cho tế bào phát triển tốt nhất, hàm lượng hoạt chất cao nhất.
- Hormon thực vật
Hormon thực vật hoặc các chất kích thích sinh trưởng rất cần thiết đối với các tế bào chưa biệt hoá để đẩy mạnh sự tăng trưởng của nhiều dòng tế bào. Hormon thực vật thường dùng trong sinh khối gồm 2 nhóm chính:
+ Nhóm khung auxin: gồm 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), 1- naphtalenacetic acid (NAA), indole-3-acetic acid (IAA) và indole-3-butyric acid (IBA) thường xuyên được sử dụng với nồng độ trong khoảng 0,1 – 50 àM dựng làm chất kớch thớch tăng trưởng trong nuụi cấy tế bào. Đặc biệt, trong sinh khối tế bào, NAA và 2,4-D là những chất không thể thiếu nhất là ở giai đoạn nuôi cấy tạo callus [11], [44], [64].
+ Nhóm cytokinin: gồm kinetin và benzyladenin có vai trò làm tăng sinh tổng hợp nguyên liệu di truyền, kích thích quá trình sinh trưởng làm cho tế bào phát triển nhanh hơn. Các chất này thường được sử dụng kết hợp với nhóm auxin như 2,4-D, NAA. Mỗi loại tế bào thực vật khác nhau yêu cầu
nồng độ hormon thực vật khác nhau cho sự phát triển của tế bào cũng như tạo các sản phẩm thứ cấp của nó. Việc lựa chọn các chất kích thích sinh trưởng thích hợp nhất đối với mỗi loại thực vật là một khâu trong quá trình nghiên cứu tạo sinh khối [44], [119].
Ngoài 2 nhóm trên, các chất khác: acid gilberilic và các ethylen... cũng có thể được sử dụng để kích thích tăng tổng hợp hoạt chất [67].
- Các biện pháp kích thích làm tăng hàm lượng hoạt chất
Các kỹ thuật phổ biến để tăng tích lũy hoạt chất là: dùng các chất kích thích sinh tổng hợp hoạt chất (elicitor) hoặc các tiền chất cho quá trình sinh tổng hợp hoạt chất, kỹ thuật nuôi cấy 2 pha, nghiệm pháp gen kích hoạt, bất động tế bào, nuôi cấy 2 giai đoạn... Trong đó, các elicitor chất làm tăng hàm lượng hoạt chất thường được sử dụng. Elicitor là các chất có bản chất hoá học khác nhau từ nhiều nguồn gốc, có tác dụng kích thích tạo các sản phẩm chuyển hoá thứ cấp để chống đỡ lại các mầm bệnh khi xâm nhập vào tế bào thực vật, trong đó có việc kích thích làm tăng sinh tổng hợp các hoạt chất.
Bình thường, hệ thống tự bảo vệ trong tế bào được khởi động khi có tác nhân có hại tác động vào tế bào [22], [65].
Những chất có khả năng kích thích khởi động hệ thống tự bảo vệ này gọi là các elicitor. Elicitor liên kết với receptor trên màng tế bào. Các tín hiệu của elicitor được truyền đi thông qua các chất truyền tín hiệu thứ cấp (kênh ion, GTP, phân tử oxy hoạt động, inositol 1,4,5 - trisphosphate, các enzym, các chất trung gian dẫn truyền ...) dẫn đến kết quả cuối cùng kích thích sinh tổng hợp các sản phẩm chuyển hoá thứ cấp, nhằm bảo vệ tế bào, trong đó có các hoạt chất sinh học [65]. Elicitor được chia làm 2 loại:
+ Elicitor hữu sinh (biotic elicitor): gồm các chất (nội sinh hay ngoại sinh) có nguồn gốc từ các cơ thể sống: thực vật, vi sinh vật, nấm... Elicitor ngoại sinh (exogenous elicitor) là những thành phần đã có hoạt tính kích thích tổng hợp hoạt chất. Elicitor nội sinh (endogenous elicitor) là sản phẩm tương
tác của chính các yếu tố gây bệnh với tế bào thực vật sinh ra. Đây là các chất kích thích sinh tổng hợp hoạt chất thực sự [102].
+ Elicitor vô sinh (abiotic elicitor): là các chất các yếu tố không có nguồn gốc từ cơ thể sống gồm các chất hoá học tổng hợp (acid salicylic, acid benzoic, acid ferulic, acid jasmonic...), các yếu tố vật lý (ánh sáng, tia tử ngoại, nhiệt độ ...), ion kim loại nặng và những tổn thương cơ học... [102].
Khi tiến hành nghiên cứu sử dụng các elicitor, cần phải lựa chọn được loại và nồng độ elicitor cũng như thời gian tiếp xúc của từng loại elicitor thích hợp cho từng loại tế bào.
- Các nguyên tố đa lượng
Bao gồm các loại muối của nitơ, phospho, kali, calci, magnesi và sulfua.
Đây là các nguyên tố chính cần thiết cho sinh trưởng của thực vật bậc cao. Nếu cây trồng tự nhiên cần các muối vô cơ để sinh trưởng và phát triển, thì để nuôi cấy thành công những tế bào chưa biệt hóa, đòi hỏi phải cung cấp đầy đủ nguồn nitơ và các ion vô cơ như phospho, kali, calci, magne, mangan và sulfua. Trong đó, nguồn nitơ thường chiếm tỷ lệ cao [85]. Nguồn nitơ được đưa vào dưới dạng các muối amoni hoặc nitrat như NH4NO3, NaNO3 hoặc kết hợp với các muối khác như NH4H2PO4 vàCa(NO3)2. Tuy nhiên, việc cân đối giữa tỷ lệ NH4+ /NO3- rất quan trọng, vì nó ảnh hưởng tới hàm lượng hoạt chất có trong sinh khối tế bào [11]. Theo S. Lui và cs [86] trong sinh khối tế bào sâm Hoa Kỳ (Panax notoginseng Wall.) hàm lượng saponin tăng khi tỷ lệ NH4+/NO3-
giảm. Nhưng nếu tăng lượng amoni quá cao có thể gây độc cho tế bào và hàm lượng saponin lại giảm.
- Các nguyên tố vi lượng
Bao gồm các loại muối của sắt, kẽm, mangan, đồng, molybden và coban ở dạng vi lượng. Các vi khoáng chất là những thành phần không thể thiếu đối với tế bào thực vật. Các chất này đóng vai trò như là các coenzym tham gia vào các quá trình sinh lý, sinh hóa của tế bào. Đặc biệt, chúng tham gia vào kích hoạt các enzym của quá trình sinh tổng hợp các hoạt chất [86], [99].
- Các phụ gia hữu cơ
Một lượng nhỏ các loại vitamin (myoinositol, thiamin, acid nicotinic, pyridoxine, riboflavin...) đóng vai trò là các coenzym tham gia các quá trình chuyển hóa của tế bào nên có tác dụng kích thích sự phát triển của tế bào. Các acid amin (thường cho phép bỏ qua nhưng trong một số trường hợp đặc biệt thì có thể dùng) và các phụ gia hữu cơ khác (dịch chiết nấm men, dịch thủy phân casein, nước dừa, một số dịch chiết từ thực vật...) cũng chứa các yếu tố tăng trưởng góp phần kích thích tế bào phát triển. Vì vậy, chúng được thêm vào môi trường nuôi cấy, góp phần làm tế bào phát triển tốt hơn [65].
1.2.3.2. Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy
* Thời gian nuôi cấy
Thời gian nuôi cấy ảnh hưởng lớn tới tốc độ phát triển của tế bào và sinh tổng hợp các chất chuyển hoá thứ cấp. Tốc độ phát triển của các tế bào sinh vật nói chung và tế bào thực vật trong công nghệ sinh khối nói riêng đều theo một đường cong phát triển. Đường cong này gồm có 4 pha (hình 1.4) [18].
Hình 1.4. Sự phát triển của tế bào thực vật theo thời gian
* Nguồn: theo Alan H.S. (1992) [18]
- Pha tiềm tàng hay còn gọi là pha thích nghi (lag phase): tại pha này, các tế bào thực vật gần như không phát triển, nó đang thích nghi với điều kiện và môi trường nuôi cấy mới.
Pha thích ghi Pha phát triển Pha dừng Pha ly giải
Thời gian (ngày) Khối
lượng tế bào (g)
- Pha phát triển (exponent phase): ở pha này các tế bào đã trải qua thời gian thích nghi và bắt đầu phát triển với tốc độ theo hàm lũy thừa, khối tế bào phát triển nhanh tạo ra một lượng lớn. Trong giai đoạn này nếu cung cấp đầy đủ chất dinh dưỡng, tế bào có thể phát triển tối đa.
- Pha dừng (stationary phase): các tế bào gần như không phát triển và nhân lên nữa. Lượng tế bào trong môi trường tiến dần tới hằng định. Trong pha này, các tế bào thực vật bắt đầu tổng hợp các chất chuyển hoá thứ cấp.
Pha này càng dài, lượng hoạt chất trong khối tế bào càng cao. Vì vậy, cần phải cung cấp đầy đủ chất dinh dưỡng để duy trì sự tồn tại của tế bào, nhằm kéo dài thời gian sinh tích lũy các sản phẩm thứ cấp [119], [125].
- Pha ly giải hay pha suy tàn (death phase, lysis phase): trong pha này các tế bào thực vật bắt đầu chết dần, lượng tế bào giảm. Biểu hiện bên ngoài là thay đổi màu sắc tế bào và môi trường nuôi cấy, pH môi trường thay đổi. Như vậy, cần phải xác định điểm kết thúc của quá trình nuôi cấy, đó là thời điểm trước khi chuyển sang pha ly giải. Khi đó sẽ thu được khối lượng tế bào lớn nhất, hàm lượng hoạt chất cao nhất và không bị lãng phí môi trường [9].
* Nhiệt độ nuôi cấy
Nhiệt độ nuôi cấy có ảnh hưởng quan trọng tới sự phát triển khối tế bào thực vật và sự hình thành các chất chuyển hoá thứ cấp. Mỗi loại tế bào thực vật có một khoảng nhiệt độ thích nghi nhất định. Nhiệt độ quá thấp sẽ làm tế bào ngừng phát triển hoặc chết đi, nhiệt độ quá cao sẽ gây chết tế bào. Trong khoảng nhiệt độ tồn tại của tế bào thực vật, thường có một nhiệt độ tối ưu. Tại nhiệt độ này, sự phát triển của khối tế bào đạt tốc độ tối đa. Tuy nhiên, khác với vi khuẩn và vi nấm, tế bào thực vật thường thích nghi ở khoảng nhiệt độ thấp từ 20 - 280C [7], [69].
* pH môi trường nuôi cấy
Ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của tế bào và sinh tổng hợp của hoạt chất sinh học vẫn chưa được nghiên cứu đầy đủ. Tuy nhiên, mô thực vật có khả năng thích nghi lớn với sự thay đổi của pH. Trong môi trường nuôi
cấy, pH có thể được điều chỉnh bằng chính các tế bào thực vật để tối ưu hoá môi trường nuôi cấy. pH có ảnh hưởng tới sự phát triển của tế bào và sự tổng hợp các chất chuyển hoá thứ cấp [32], [55].
* Nồng độ oxy hoà tan
Nhìn chung, sự phát triển của tất cả các tế bào hiếu khí đều cần sự có mặt của oxy. Oxy cần thiết cho quá trình hô hấp của tế bào, phân cắt các phân tử hữu cơ tạo năng lượng cho các quá trình phát triển của cơ thể sinh vật. Tốc độ phát triển của tế bào thực vật càng cao càng cần nhiều oxy. Trong thực tế, các tế bào thực vật phát triển tương đối chậm, chính vì vậy nồng độ oxy cung cấp cho tế bào không cần cao [37], [119].
1.3. SINH KHỐI TẾ BÀO THÔNG ĐỎ SẢN XUẤT PACLITAXEL