CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. XÂY DỰNG QUY TRÌNH TẠO SINH KHỐI TẾ BÀO THÔNG ĐỎ
3.1.1. Tạo callus thông đỏ
3.1.1.1. Lựa chọn chất sát khuẩn mẫu cấy
Chuẩn bị môi trường SH để nuôi cấy. Mẫu cấy sau khi thu hái được rửa sạch bằng nước, ngâm trong nước xà phòng khoảng 10 phút, rửa sạch lại bằng nước cất. Tiệt khuẩn bằng các chất sát khuẩn khác nhau: dung dịch NaClO 1%, dung dịch H2O2 30% và dung dịch HgCl2 0,07%, sử dụng riêng lẻ hoặc kết hợp với tween 80 (0,01%) trong thời gian 10 - 25 phút. Sau đó tráng lại bằng nước cất vô khuẩn. Cắt mẫu thành những lát nhỏ, kích thước 2 x 2 x 1 mm, khối lượng khoảng 100 mg. Cấy mẫu vào môi trường thạch SH bổ sung NAA (0,5 mg/l) và kinetin (0,1 mg/l). Nuôi cấy trong điều kiện vô khuẩn và không có ánh sáng. Sau 35 ngày nuôi cấy trong môi trường kết quả tỷ lệ tạo thành callus được trình bày trong bảng 3.1 và hình 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát lựa chọn chất sát khuẩn
STT Chất sát khuẩn Số mẫu
Tỷ lệ nhiễm khuẩn (%)
Tỷ lệ không tạo
thành callus (%)
Tỷ lệ tạo thành callus (%)
1 NaClO 100 56 33 11
2 HgCl2 100 37 36 27
3 H2O2 100 43 42 15
4 NaClO + Tween 80 100 44 35 21
5 HgCl2 + Tween 80 100 29 33 38
6 H2O2 + Tween 80 100 35 49 16
Kết quả bảng 3.1 cho thấy: sử dụng dung dịch HgCl2 0,07% kết hợp với tween 80 (0,01%) cho tỷ lệ nhiễm khuẩn thấp nhất là 29% đồng thời tỷ lệ tạo thành callus cao nhất đạt 38%.
Hình 3.1. Một số hình ảnh các mẫu thí nghiệm trong nuôi cấy callus
A- Mẫu tự nhiên; B-Mẫu cấy; C, F-Callus; D-Mẫu bị nhiễm, E-Mẫu bị chết
3.1.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian tiệt khuẩn
Sau khi lựa chọn được chất sát khuẩn là HgCl2 và tween 80, khảo sát ảnh hưởng của thời gian tiệt khuẩn đến tỷ lệ tạo thành callus thông đỏ bằng cách lựa chọn các mức thời gian tiệt khuẩn là 13, 15, 17, 19, 21, 23 phút. Sau 35 ngày nuôi cấy trên môi trường SH, tỷ lệ tạo thành callus được trình bày ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát thời gian tiệt khuẩn.
Thời gian tiệt khuẩn
(phút)
Số mẫu cấy
Tỷ lệ nhiễm khuẩn
(%)
Tỷ lệ không tạo thành callus (%)
Tỷ lệ tạo thành callus
(%)
13 100 43 32 25
15 100 29 33 38
17 100 25 30 45
19 100 19 48 33
21 100 12 59 29
23 100 6 81 13
D E F
A B C
Kết quả bảng 3.2 và hình 3.1 cho thấy: với thời gian tiệt khuẩn 17 phút, tỷ lệ tạo thành callus cao nhất đạt 45% và tỷ lệ mẫu không tạo thành callus thấp nhất đạt 30%.
3.1.1.3. Khảo sát lựa chọn môi trường nuôi cấy
Lựa chọn được 4 loại môi trường (thành phần như bảng 3.3) để nuôi cấy callus là SH, MS, B5 và White có bổ sung NAA (0,5 mg/l) và kinetin (0,1mg/l). Sau 35 ngày nuôi cấy callus thông đỏ, tính tỷ lệ tạo thành callus trên các môi trường khác nhau, kết quả được trình bày trong bảng 3.4.
Bảng 3.3. Thành phần các loại môi trường nuôi cấy (Đơn vị: mg/l)
Thành phần Môi trường MS
Môi trường White
Môi trường B5
Môi trường SH
(NH4)2SO4 - - 134 -
MgSO4ì 7H2O 370 720 500 400
Na2SO4 - 200 - -
KC1 - 65 - -
CaC12ì 2H2O 440 - 150 200
KNO3 1900 80 3000 2500
Ca(NO3)2ì 4H2O - 300 - -
NH4NO3 1650 - - -
NaH2PO4ì H2O - 16,5 150 -
NH4H2PO4 - - - 300
KH2PO4 170 - - -
FeSO4ì 7H2O 27,8 - 27,8 15
Na2EDTA 37,3 - 37,3 20
MnSO4ì 4H2O 22,3 7 10 10
ZnSO4ì 7H2O 8,6 3 2 0,1
CuSO4ì 5H2O 0,025 - 0,025 0,2
Fe2(SO4)3 - 2,5 - -
CoC12ì 6H2O 0,025 - 0,025 0,1
KI 0,83 0,75 0,75 1,0
H3BO3 6,2 1.5 3 5
Na2MoO4ì 2H2O 0,25 - 0,25 0,1 Saccharose 30.000 20.000 20.000 30.000 Myo-Inositol 100 - 100 1,000 Nicotinic Acid 0,5 0,5 1,0 0,5 Pyridoxin HC1 0,5 0,1 1,0 0,5 Thiamin HC1 0,1 0,1 10 5
Ca-Pantothenat - 1 - -
Glycin 2 3 - -
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát lựa chọn môi trường nuôi cấy
STT Môi trường
Số mẫu cấy
Số mẫu tạo thành
callus
Tỷ lệ tạo thành
callus (%) p
1 MS 100 12 12% p3-1<0,05
2 SH 100 45 45% p3-2<0,05
3 B5 100 73 73% *
4 White 100 15 15% p3-4<0,05
(Chú thích: * - lô nghiên cứu được so sánh với các lô tương ứng khác) Kết quả bảng 3.4 cho thấy: Trong 4 môi trường nghiên cứu tạo callus, B5 là môi trường cho tỷ lệ tạo thành callus cao nhất đạt 73% (với p<0,05) tiếp đến, môi trường SH cho tỷ lệ tạo callus là 45%. Hai môi trường White và MS cho tỷ lệ tạo callus thấp hơn là 15% và 12%. Như vậy B5 là môi trường phù hợp cho nuôi cấy tạo callus thông đỏ.
Hình 3.2. Callus trên các môi trường khác nhau
a: Môi trường B5; b: môi trường MS
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của môi trường tới sự phát triển của callus STT Môi trường Số mẫu
cấy
Khối lượng
callus (mg) p 1 MS 50 14,3 ± 1,5 p3-1<0,05 2 SH 50 20,1 ± 2,1 p3-2<0,05
3 B5 50 24,5 ± 2,2 *
4 White 50 12,9 ± 1,5 p3-4<0,05
a b
Hình thái callus trên các môi trường khác nhau cũng khác nhau. Tế bào nuôi cấy trong môi trường B5 và SH, callus mọc sáng và lớn hơn so với callus nuôi cấy ở môi trường MS và White (hình 3.2). Kết quả xác định khối lượng callus phát triển trong các môi trường khác nhau trình bày ở bảng 3.5.
Trong 4 môi trường khảo sát, tốc độ phát triển của tế bào tốt nhất trong môi trường B5 với tỷ lệ tăng trưởng sau 35 ngày cao hơn so với các môi trường còn lại (với p< 0,05 ).
3.1.1.4. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy
Sau khi lựa chọn được môi trường nuôi cấy callus phù hợp là B5, khảo sát tốc độ phát triển của callus trong khoảng thời gian từ ngày thứ 10 đến ngày thứ 50. Kết quả khảo được thể hiện ở hình 3.3.
0 50 100 150 200 250 300 350 400
10 15 20 25 30 35 40 45 50
Thoi gian
Khoi luong
Hình 3.3. Đồ thị biểu diễn khối lượng callus theo thời gian
Từ kết quả hình 3.3 cho thấy: sau 35 ngày nuôi cấy callus thông đỏ đạt khối lượng cao nhất. Như vậy chu kỳ nuôi cấy tế bào thông đỏ là 35 ngày.
3.1.1.5. Ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng
* Ảnh hưởng của loại chất kích thích sinh trưởng
Lựa chọn 4 chất kích thích sinh trưởng thuộc 2 nhóm: auxin (2,4-D và NAA nồng độ 1 mg/l) và cytokinin (kinetin, BAP nồng độ lần lượt là 0,1 mg/l
(ngày) (mg)
và 0,5 mg/l) phối hợp với nhau và được thêm vào môi trường B5, nuôi cấy trong thời gian 35 ngày. Kết quả được trình bày ở bảng 3.6.
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của loại chất kích thích sinh trưởng tới sự phát triển của callus
STT Lô nghiên cứu số mẫu cấy
Khối lượng
callus (mg) p 1 2,4-D + kinetin 50 17,8 ± 1,4 P3-1<0,05 2 2,4-D + BAP 50 19,8 ± 2,7 P3-2<0,05 3 NAA + kinetin 50 24,8 ± 2,5 * 4 NAA + BAP 50 21,2 ± 1,8 P3-4<0,05
Trong 4 cặp chất kích thích sinh trưởng sử dụng trong nuôi cấy tế bào thông đỏ thì cặp phối hợp giữa NAA và kinetin cho tốc độ phát triển của tế bào cao hơn so với 3 cặp còn lại (p<0,05).
* Ảnh hưởng của nồng độ NAA
Sau khi đã lựa chọn được cặp chất kích thích sinh trưởng là NAA và kinetin sử dụng cho nuôi cấy tạo callus thông đỏ, tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nồng độ NAA tới tốc độ phát triển của tế bào. Tiến hành nuôi cấy callus thông đỏ trong môi trường B5 bổ sung kinetin nồng độ 0,1 mg/l phối hợp với NAA ở các nồng độ 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 mg/l nuôi cấy trong 35 ngày. Kết quả trình bày ở bảng 3.7.
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của nồng độ NAA tới sự phát triển callus STT
Nồng độ NAA (mg/l)
số mẫu cấy
Khối lượng callus
(mg)
p
1 0,5 50 23,6 ± 2,1 P4-1< 0,05
2 1,0 50 24,1 ± 2.3 P4-2< 0,05
3 1,5 50 25,0 ± 1,8 p4-3 < 0,05
4 2,0 50 26,8 ± 1,9 *
5 2,5 50 25,6 ± 1,7 p4-5 > 0,05
Kết quả bảng 3.6 cho thấy: khi tăng nồng độ NAA tốc độ phát triển của tế bào càng tăng và đạt khối lượng lớn nhất ở nồng độ 2,0 mg/l, với p<0,05.
Tuy nhiên, nếu tiếp tục tăng nồng độ NAA tới 2,5 mg/l thì khối lượng tế bào
tăng không đáng kể (p>0,05). Như vậy, nồng độ NAA phù hợp cho nuôi cấy tạo callus là 2,0 mg/l.
* Ảnh hưởng của nồng độ kinetin
Nuôi cấy tạo callus trong môi trường B5 có bổ sung NAA (2,0 mg/l) và kết hợp kinetin với các mức nồng độ khác nhau từ 0,1 đến 0,5 mg/l. Kết quả sau 35 ngày nuôi cấy được thể hiện trong bảng 3.8.
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của nồng độ kinetin tới sự phát triển callus STT
Nồng độ kinetin
(mg/l)
số mẫu cấy
Khối lượng callus
(mg) p
1 0,1 50 24,5 ± 1,8 p1-2 <0,05
2 0,2 50 27,9 ± 2,3 *
3 0,3 50 26,1 ± 1,9 p2-3 >0,05 4 0,4 50 25,9 ± 2,4 p2-4 >0,05 5 0,5 50 26,2 ± 2,2 p2-5 >0,05
Khi nồng độ kinetin từ 0,3 đến 0,5 mg/l thì khối lượng callus sau 35 ngày nuôi cấy thay đổi không đáng kể (p>0,05) so với mẫu nuôi khi dùng nồng độ 0,2 mg/l. Như vậy, nồng độ kinetin phù hợp cho nuôi cấy tạo callus là 0,2 mg/l.