4.1.1. Về nuụi cấy tạo callus thụng đỏ
Trong sinh khối tế bào thực vật, giai đoạn tạo callus đúng vai trũ quyết định tới thành cụng của cả quy trỡnh. Nếu tạo được dũng callus phỏt triển tốt, khụng bị biệt húa, khả năng sinh hoạt chất cao sẽ gúp phần quan trọng tới năng suất và hiệu quả của quy trỡnh sinh khối. Vỡ vậy, cần phải nghiờn cứu cỏc điều kiện để tạo ra callus tốt sử dụng cho cỏc bước tiếp theo của quy trỡnh sinh khối tế bào thực võt. Để tạo được callus cú thể sử dụng nhiều loại mụ ở cỏc bộ phận khỏc nhau. Thụng thường hay sử dụng cỏc mụ non như đỉnh sinh trưởng, rẽ non, lỏ non, cành non [87], điều này gúp phần cho callus tạo ra phỏt triển nhanh hơn so với cỏc mụ lấy tại cỏc bộ phận tế bào già. Đối với tế bào thụng đỏ, cỏc nghiờn cứu trờn thế giới thường sử dụng cành non, lỏ non và hạt, tuy nhiờn cành non là bộ phận hay được sử dụng hơn cả [48]. Trong luận ỏn này, sử dụng bộ phận đưa vào nuụi cấy là cành non thụng đỏ.
4.1.1.1. Về lựa chọn chất sỏt khuẩn và thời gian tiệt khuẩn mẫu cấy
Nghiờn cứu tạo callus là quỏ trỡnh tỏch và cấy chuyển cỏc mụ, tế bào từ cõy tự nhiờn vào nuụi cấy trong điều kiện vụ khuẩn. Vỡ vậy, việc vụ khuẩn mẫu cấy quyết định tới sự thành bại của cụng nghệ. Để đảm bảo độ vụ khuẩn cho mẫu nuụi cấy, ngoài việc kiểm soỏt độ vụ khuẩn của mụi trường, dụng cụ và thiết bị nuụi cấy thỡ việc lựa chọn chất tiệt khuẩn và thời gian tiệt khuẩn thớch hợp là rất quan trọng, nhằm làm giảm thiểu tối đa mẫu cấy bị nhiễm vi khuẩn và vi nấm, đồng thời cũng giảm cả tỷ lệ mẫu bị chết do nhiễm độc cỏc chất sỏt khuẩn. Kết quả nghiờn cứu cho thấy khi sử dụng chất sỏt khuẩn HgCl2 nồng độ 0,07% kết hợp với chất hoạt động bề mặt tween 80 cho hiệu quả tiệt khuẩn tốt nhất với tỷ lệ tạo thành callus khụng bị nhiễm khuẩn là 38% (bảng 3.1). Kết quả này cũng phự hợp với nghiờn cứu của Fornalố và cs khi tiệt khuẩn mẫu cấy thụng đỏ Chõu Âu cũng sử dụng HgCl2 kết hợp với tween 20 [52].
Về thời gian tiệt khuẩn mẫu cấy thụng đỏ, khi tiệt khuẩn quỏ lõu mẫu cấy sẽ hạn chế bị nhiễm khuẩn hơn, tuy nhiờn tỷ lệ khụng tạo thành callus cũng tăng lờn. Điều này được giải thớch là do thời gian tiếp xỳc dài với chất sỏt khuẩn sẽ làm mẫu bị ngộ độc chất sỏt khuẩn gõy thõm đen và chết sau 5- 10 ngày nuụi cấy. Kết quả khảo sỏt ảnh hưởng của thời gian tiệt khuẩn cho thấy mẫu thụng đỏ khi tiệt khuẩn 17 phỳt thỡ tỷ lệ tạo thành callus trong mụi trường thạch là cao nhất đạt 45% (Bảng 3.2). Kết quả này cũng phự hợp với cỏc kết quả nghiờn cứu của cỏc tỏc giả về việc sử dụng HgCl2 để tiệt khuẩn mẫu cấy thực vật như nuụi cấy tế bào sõm Ngọc Linh, tế bào dừa cạn [7].
4.1.1.2. Về lựa chọn mụi trường tạo callus thụng đỏ
Mỗi loại thực vật đều cần một mụi trường thớch hợp để nuụi cấy sinh khối tế bào núi chung và tạo callus núi riờng. Cỏc loại sõm thường sử dụng mụi trường MS để nuụi cấy, trong khi nuụi cấy callus dừa cạn hay sử dụng mụi trường SH hoặc B5 [7]. Trong nghiờn cứu này, 4 loại mụi trường thụng dụng đó được khảo sỏt để tạo sinh khối tế bào thực vật và đỏnh giỏ kết quả tạo thành callus thụng đỏ. Kết quả khảo sỏt cho thấy mụi trường Gamborg (B5) cho tỷ lệ tạo callus cao nhất 73%, mụi trường Murashige - Skoog (MS) cho tỷ lệ thấp nhất 12% (Bảng 3.4). Tốc độ phỏt triển của tế bào trờn mụi trường B5 cũng cao hơn trờn cỏc mụi trường khỏc (Bảng 3.5). Hỡnh thỏi callus thụng đỏ trờn cỏc mụi trường khỏc nhau cũng khụng giống nhau. Callus mọc trong mụi trường B5 và SH, tế bào màu vàng nhạt, tươi và sỏng khụng bị nhiễm khuẩn. Callus mọc trờn mụi trường MS và White màu nõu sẫm và tế bào phỏt triển chậm (Hỡnh 3.2). Kết quả này cũng phự hợp với nghiờn cứu về lựa chọn mụi trường B5 cho tạo callus thụng đỏ Thỏi Bỡnh Dương (T. brevifolia) với tỷ lệ khoảng 75%, thụng đỏ Chõu Âu (T. baccata) tỷ lệ 30%, thụng đỏ Nhật Bản (T. cuspidata) tỷ lệ trờn 50% của Wickremesinhe và Arteca [48], nuụi cấy tạo callus thụng đỏ Trung Quốc (T. chinensis) của Luo và cs [91]. Từ kết quả khảo sỏt lựa chọn mụi trường B5 cho nuụi cấy tạo callus thụng đỏ.
4.1.1.3. Về thời gian chu kỳ nuụi cấy callus thụng đỏ
Trong kỹ thuật sinh khối tế bào thực vật, xỏc định thời gian của một chu kỳ nuụi cấy callus thực sẽ gúp phần trỏnh được lóng phớ mụi trường mà tế bào thu được vẫn đảm bảo phỏt triển tốt. Nếu thu hoạch nhanh thỡ lóng phớ vỡ callus cũn cú thể tiếp tục sinh trưởng, trong khi mụi trường vẫn cũn chất dinh dưỡng. Nếu thu hoạch muộn thỡ khụng tiết kiệm được thời gian, thậm chớ callus cú thể bị chết hoặc đổi màu do chất dinh dưỡng trong mụi trường đó cạn kiệt [18], [47].
Kết quả nghiờn cứu cho thấy: từ ngày thứ 25 đến ngày thứ 35 khối lượng của callus tăng nhanh. Sau ngày thứ 35, tốc độ tăng của callus chậm lại và gần như khụng phỏt triển cho đến ngày thứ 40. Đến ngày thứ 40 - 45, khối lượng callus lại giảm. Như vậy, ngày thứ 35 là thời điểm thớch hợp nhất để thu hoạch hoặc tiếp tục cấy chuyển callus thụng đỏ (Hỡnh 3.3). Kết quả này phự hợp với kết quả nghiờn cứu của Enaksha và cs về thời điểm cấy chuyển callus của loài T. media (35 - 42 ngày) [48], thụng đỏ Chõu Âu (T. baccata)
từ 28-42 ngày [21]. So với loài thụng đỏ Trung Quốc (T. chinensis) thỡ thời gian tạo callus nhanh hơn, theo nghiờn cứu của Parc [110] thấy rằng chu kỳ nuụi cấy của callus của loài T. baccata trong mụi trường B5 là 42-56 ngày.
4.1.1.4. Vềảnh hưởng của loại chất kớch thớch sinh trưởng đến callus thụng đỏ
Chất kớch thớch sinh trưởng đúng vai trũ quan trọng đối với sự phỏt triển của tế bào, đặt biệt cỏc tế bào mới bị tỏch ra khỏi cơ thể, giỳp duy trỡ quỏ trỡnh phõn chia tế bào, đồng thời gúp phần tăng sinh mụ sẹo, hàn gắn cỏc tổn thương khi bị tỏc động từ bờn ngoài [18], [64], [121].
Thụng thường trong giai đoạn nghiờn cứu tạo callus thỡ cỏc chất kớch thớch sinh trưởng hay được dựng là 2,4-D, NAA, IBA [96]. Với cỏc loài thụng đỏ thỡ NAA được sử dụng thường xuyờn trong nuụi cấy tạo callus cũng như nuụi cấy trong mụi trường lỏng [125], [127]. Kết quả nghiờn cứu cho thấy: khi sử dụng chất kớch thớch sinh trưởng khỏc nhau thỡ tế bào phỏt triển cũng khỏc
nhau. Ở mụi trường sử dụng NAA và kinetin, tốc độ phỏt triển của callus thụng đỏ tốt hơn mụi trường sử dụng 2,4-D hoặc NAA kết hợp với BAP với p < 0,05 (Bảng 3.6). Vỡ vậy, NAA và kinetin được lựa chọn là những chất kớch thớch sinh trưởng cho nuụi cấy tạo callus thụng đỏ.
4.1.1.5. Vềảnh hưởng của nồng độ NAA
Trong quỏ trỡnh nuụi cấy tạo callus cũng như duy trỡ nuụi cấy khối tế bào thụng đỏ, nhất thiết phải sử dụng cỏc chất kớch thớch sinh trưởng đặc biệt là cỏc chất thuộc nhúm auxin (2,4-D, NAA, IBA, IAA). Đú là những chất giỳp cho quỏ trỡnh phõn chia tế bào nhanh hơn, đồng thời cú thể làm hạn chế quỏ trỡnh biệt húa của tế bào. Vỡ vậy, cần phải chọn được chất nào phự hợp nhất và nồng độ tối ưu nhất [32], [64], [126].
Qua khảo sỏt, đó lựa chọn được NAA là chất kớch thớch sinh trưởng phự hợp với sự phỏt triển của callus thụng đỏ. Tuy nhiờn, khi sử dụng NAA ở cỏc nồng độ từ 0,5 mg/l đến 2,5 mg/l thỡ tốc độ phỏt triển của callus cũng thay đổi. Khối lượng callus của nhúm dựng NAA với nồng độ 2,0 mg/l là cao hơn so với nhúm NAA ở nồng độ 0,5 mg/l, 1,0 mg/l và 1,5 mg/l sự khỏc biệt cú ý nghĩa thống kờ (p < 0,05). Tuy nhiờn, ở cỏc nhúm dựng NAA, nồng độ 2,5 mg/l so với nhúm dựng nồng độ 2,0 mg/l, khối lượng của callus khụng khỏc biệt (p > 0,05, bảng 3.7). Như vậy, nồng độ NAA thớch hợp dựng cho duy trỡ nuụi cấy callus thụng đỏ là 2,0 mg/l. Kết quả này cũng phự hợp với kết quả của một số nghiờn cứu khỏc trong nuụi cấy cỏc loài thụng đỏ Thỏi Bỡnh Dương, thụng đỏ Chõu Âu, thụng đỏ Canada, thụng đỏ Nhật Bản [40], [48], [119].
4.1.1.6. Ảnh hưởng của nồng độ kinetin
Việc sử dụng phối hợp cỏc nhúm chất kớch thớch sinh trưởng trong nuụi cấy tế bào thực vật là rất quan trọng vỡ chỳng cú tỏc dụng hiệp đồng với nhau. Nhúm auxin giỳp tăng nhanh quỏ trỡnh phõn bào, làm cho tế bào phỏt triển tốt hơn, trong khi nhúm cytokinin (kinetin, BAP) cú tỏc dụng chống lại sự già
húa của tế bào. Do vậy, đa phần cỏc nghiờn cứu nuụi cấy tế bào đều sử dụng kết hợp 2 nhúm hợp chất này với nhau.
Kết quả khảo sỏt đó lựa chọn được kinetin phối hợp với NAA là phự hợp trong nuụi cấy tạo callus thụng đỏ. Khi nồng độ kinetin sử dụng từ 0,1 mg/l đến 0,2 mg/l thỡ tốc độ phỏt triển của tế bào tăng nhanh sự khỏc biệt cú ý nghĩa thống kờ (p<0,05, bảng 3.8). Tuy nhiờn, nếu tăng nồng độ kinetin lờn từ 0,3 mg/l đến 0,5 mg/l thỡ khối lượng callus thu được thay đổi khụng cú sự khỏc biệt (p>0,05). Kết quả nghiờn cứu cũng phự hợp với cỏc nghiờn cứu nuụi cấy tạo callus thụng đỏ Thỏi Bỡnh Dương (T. brevifolia) của Enaksha khi sử dụng NAA kết hợp với 0,2 mg/l kinetin [48]. Tuy nhiờn, so với nuụi cấy tạo callus thụng đỏ Chõu Âu (T. baccata) thỡ hàm lượng kinetin ớt hơn. Fornale và cs [52] dựng kinetin tới 0,8 mg/l. Brunakova và cs [30] dựng 0,5 mg/l cho nuụi cấy tạo callus. Thụng thường hàm lượng kinetin hay sử dụng trong nuụi cấy tạo callus trong khoảng 0,1 -10 mg/l [87]. Kết quả cho thấy nồng độ kinetin thớch hợp cho nuụi cấy tạo callus thụng đỏ là 0,2 mg/l.
4.1.2. Về duy trỡ nuụi cấy callus thụng đỏ trong mụi trường thạch
Sau khi tạo được callus thụng đỏ, để cú thể nuụi cấy được trong mụi trường lỏng cần cú giai đoạn nuụi cấy duy trỡ trong mụi trường thạch nhằm mục đớch cho tế bào phỏt triển tốt hơn, khả năng sinh trưởng cao hơn và đặc biệt tế bào ớt cú khả năng biệt húa thành cỏc mụ, cơ quan khỏc. Sau một số lần cấy chuyển trong mụi trường thạch thớch hợp, sẽ chuyển sang mụi trường lỏng.
4.1.2.1. Về sự thớch nghi của callus thụng đỏ trong mụi trường thạch
Callus thụng đỏ sau khi đó được tạo ra trong mụi trường thạch mềm, cỏc tế bào cũn cứng và tiếp tục biệt húa thành thành cỏc cơ quan tổ chức khỏc như rễ, chồi thõn. Vỡ vậy, cần phải cú giai đoạn duy trỡ nuụi cấy trong mụi trường thạch trong một thời gian nhất định để đảm bảo tế bào khụng cũn biệt húa. Ngoài ra, tế bào phải cú hỡnh thỏi mềm, xốp thớch hợp cho việc nuụi cấy trong mụi trường lỏng. Từ callus chỳng cú thể bị biệt húa trở lại tạo ra cỏc mụ, cơ
quan khỏc nhau và cú thể hỡnh thành những cõy mới tựy theo tỏc động của điều kiện nuụi cấy và thành phần mụi trường [18], [87], [121].
Với tế bào thụng đỏ được tạo ra và cấy chuyển nhiều lần trong mụi trường B5 cho thấy tế bào phỏt triển chậm, sau 4-5 lần cấy chuyển tế bào vẫn cứng và cú hiện tượng biệt húa thành chồi (hỡnh 3.4). Trong khi cấy chuyển tế bào sang mụi trường thạch SH thỡ tế bào phỏt triển tốt hơn, hỡnh thỏi tế bào qua 4 lần cấy chuyển đó mềm, xốp (Hỡnh 3.5). Như vậy, mụi trường SH là phự hợp cho duy trỡ nuụi cấy tế bào thụng đỏ. Kết quả nghiờn cứu cho thấy cú khỏc biệt so với cỏc nghiờn cứu về mụi trường duy trỡ nuụi cấy callus cỏc loài thụng đỏ khỏc của Cusidú và Luo sử dụng mụi trường B5 cho nuụi cấy tế bào thụng đỏ Chõu Âu và thụng đỏ Trung Quốc [42], [91].
Tốc độ sinh trưởng của callus thụng đỏ qua cỏc lần cấy chuyển cũng thay đổi. Ở những lần cấy chuyển đầu tiờn, tế bào phỏt triển chậm với tỷ lệ tăng trưởng khoảng 1,87 lần. Tuy nhiờn, cỏc lần cấy chuyển tiếp theo tốc độ phỏt triển cao hơn với tỷ lệ tăng trưởng của lần thứ 2 là 2,25 lần, lần cấy thứ 3 là 2,78 lần, lần thứ 4 là 3,51 lần và lần thứ 5 là 3,72 lần. Điều này cho thấy sau khi cấy chuyển nhiều lần cỏc tế bào mới dần thớch nghi với thành phần mụi trường mới. Với tế bào thụng đỏ sau lần cấy chuyển thứ 4-5 thỡ tốc độ phỏt triển ổn định (bảng 3.9). Kết quả này phự hợp với cỏc tỏc giả nước ngoài nghiờn cứu về nuụi cấy callus cỏc loài thụng đỏ khỏc khỏc với chu kỳ cấy chuyển 5-7 lần [52], [110].
4.1.2.2. Vềảnh hưởng của nồng độ saccharose đến sự phỏt triển của callus
thụng đỏ
Nguồn hydratcarbon đúng vai trũ quan trọng cung cấp chất dinh dưỡng cho tế bào phỏt triển, đặc biệt khi tế bào đó bị tỏch ra khỏi cõy. Thụng thường trong nghiờn cứu nuụi cấy tế bào cỏc loài thụng đỏ thường sử dụng cỏc loại đường khỏc nhau như glucose, saccharose, maltose, fructose, cú thể sử dụng riờng lẻ hay kết hợp. Cỏc kết quả nghiờn cứu cho thấy: khi nồng độ saccharose sử dụng từ 10 đến 15 g/l thỡ tốc độ phỏt triển tế bào đạt 2,48 lần và 2,65 lần
thấp hơn so với sử dụng ở nồng độ 20 g/l đạt 3,72 lần (sự khỏc biệt cú ý nghĩa thống kờ với p < 0,05). Tuy nhiờn, nếu tăng nồng độ saccharose sử dụng lờn trờn 20 g/l thỡ tốc độ phỏt triển của tế bào lại giảm (bảng 3.10). Điều này cú thể do bản thõn saccharose cũng gõy ra stress ỏp lực thẩm thấu tỏc động vào tế bào làm ức chế sự phỏt triển [102]. Kết quả nghiờn cứu cũng phự hợp với cỏc nghiờn cứu về sử dụng nồng độ saccharose khi nuụi cấy tế bào thụng đỏ Thỏi Bỡnh Dương, thụng đỏ Nhật Bản, và loài thụng đỏ lai T.x media [110] đều sử dụng nồng độ saccharose là 20 g/l. Tuy nhiờn, trong nuụi cấy của loài thụng đỏ Chõu Âu và thụng đỏ Trung Quốc nhiều tỏc giả sử dụng mụi trường B5 với hàm lượng saccharose là 30 g/l [42], [90]. Như vậy cú thể thấy mỗi loài thụng đỏ thớch nghi với mỗi loại mụi trường và hàm lượng saccharose khỏc nhau.
4.1.2.3. Về ảnh hưởng của nhiệt độ nuụi cấy đến sự phỏt triển của callus
thụng đỏ trong mụi trường thạch mềm
Nhiệt độ nuụi cấy cú vai trũ quan trọng, ảnh hưởng đến cỏc quỏ trỡnh sinh lý và sinh húa của tế bào. Nếu nhiệt độ nuụi cấy quỏ thấp cỏc quỏ trỡnh này sẽ chậm lại dẫn đến cỏc tế bào chậm phỏt triển. Tuy nhiờn, nếu tăng nhiệt độ nuụi cấy quỏ cao, tế bào thực vật cú thể chết do cỏc enzym bị mất hoạt tớnh [57], [69], [85]. Qua kết quả nghiờn cứu cho thấy khối lượng callus thụng đỏ trong cỏc mẻ nuụi cấy ở khoảng nhiệt độ từ 22 – 240C cao hơn cỏc nhúm khỏc đạt 3,72 lần, sự khỏc biệt cú ý nghĩa (p < 0,05). Trong khi nuụi cấy ở nhiệt độ 18 – 200C chỉ đạt 2,46 lần, khi tăng nhiệt độ từ 26 - 280C thỡ tỷ lệ tăng trưởng tế bào đạt 2,61 lần, cỏc tế bào chuyển sẫm màu và phỏt triển chậm hơn nhiều so với cỏc khoảng nhiệt độ khỏc (bảng 3.11). Kết quả nghiờn cứu thu được phự hợp với nghiờn cứu của Huyng và cs [38] khi tạo callus thụng đỏ Trung Quốc ở nhiệt độ 240C, thụng đỏ Chõu Âu là 250C [106].
4.1.2.4. Về ảnh hưởng của pH mụi trường đến sự phỏt triển của callus
thụng đỏ trong mụi trường thạch mềm
Trong nuụi cấy tế bào thực vật, mỗi loại tế bào phỏt triển ở khoảng pH thớch hợp, nếu pH mụi trường quỏ cao hoặc quỏ thấp thỡ hiệu suất nuụi cấy
khụng cao, tế bào sinh trưởng chậm hoặc bị chết. Tuy nhiờn, so với tế bào vi khuẩn, nấm thỡ tế bào thực vật thường cú khoảng pH thớch nghi rộng hơn [47], [57], [111].
Kết quả nghiờn cứu cho thấy: tốc độ phỏt triển của callus thụng đỏ ở mụi trường cú pH 5,6 là cao nhất với tỷ lệ tăng trưởng đạt 3,81 lần, trong khi ở pH = 5,0 và 5,3 tỷ lệ tăng trưởng lần lượt là 2,14 và 2,98 lần. Đặc biệt khi