chớnh, xõy dựng TCCS của nguyờn liệu sinh khối tế bào thụng đỏ
2.2.2.1. Nghiờn cứu định tớnh và định lượng hoạt chất trong sinh khối tế
bào thụng đỏ
* Định tớnh cỏc nhúm hợp chất trong sinh khối
Tiến hành bằng cỏc phản ứng húa học đặc trưng theo quy trỡnh về phương phỏp nghiờn cứu cõy thuốc [15] được mụ tả theo sơ đồ hỡnh 2.1. Cỏc dung dịch chiết xuất được sử dụng để làm cỏc phản ứng gồm: Dung dịch A: chia làm 3 phần:
Phần 1: Thờm dd KOH ệXuất hiện màu đỏ ệ Cú anthraquinon Phần 2: Thờm HCl + Mg ệ Xuất hiện màu đỏ ệCú flavonoid Phần 3: Bốc hơi ệCú cặn mỡ bộo ệ Cú acid bộo
Hỡnh 2.1. Sơđồ quy trỡnh chiết xuất SKTB thụng đỏ làm phản ứng định tớnh
Dung dịch B: chia làm 5 phần, thử với thuốc thử chung của alcaloid + Phần 1: Phản ứng với thuốc thử Mayer
+ Phần 2: Phản ứng với thuốc thử Bouchardat + Phần 3: Phản ứng với thuốc thử Bertrand
+ Phần 4: Phản ứng với thuốc thử acid picric bóo hoà. + Phần 5: Phản ứng với thuốc thử Dragendorff.
Dung dịch C: chia làm 3 phần, cụ cạn:
+ Phần 1: Thờm dd H2SO4 ệ Xuất hiện màu xanh da trời ệ Cú caroten
Bột dược liệu
Bó dược liệu Dịch chiết ether
Dd kiềm Dịch chiết ether Dịch chiết alcol Bó dược liệu
Dd alcol Dd H2SO40,2% Dịch chiết ether Dịch chiết acid Bó dược liệu
+ Ether
Acid hoỏ Lọc thu tủa Hoà tan trong alcol
+ Alcol 900 + KOH 10% + HCl 1%, t0s (Dung dịch D) + H2SO4 0,2% Rửa bằng nước
+ Phần 2: Làm phản ứng Libermann ệ Xuất hiện màu tớm đỏ ệ Cú phytosterol
+ Phần 3: Cụ bốc hơi ệ Cú mựi thơm ệ Cú tinh dầu Dung dịch D chia làm 5 phần :
+ Phần D1: Thờm 4 lần thể tớch nước, kiềm hoỏ (dd KOH 10%), lọc thu cắn dịch lọc để riờng.
Cắn: Làm phản ứng Libermann ệ vũng trũn màu xanh lục ệ Cú sterol Dịch lọc: acid hoỏ bằng dd HCl ệ Xuất hiện tủa. Hoà tan tủa trong alcol . Chia dung dịch làm 2 phần .
9 Phần 1: Thờm dd KOH ệ Xuất hiện màu đỏ ệ Cú anthraquinon
9 Phần 2: Thờm HCl + Mg ệ Xuất hiện màu đỏ ệ Cú flavonoid
+ Phần D2: Acid hoỏ bằng H2SO4 2% sau đú làm phản ứng với cỏc thuốc thử chung của antranoid.
+ Phần D3: thờm đồng thể tớch nước , sau đú chia làm 2 phần:
Phần 1: Thờm natri acetat (tinh thể) + dd FeCl3 ệ Xuất hiện màu xanh đen ệ Cú tannin
Phần 2: Thờm Na2CO3 (tinh thể) ệ Sủi bọt ệ Cú acid hữu cơ
+ Phần D4: Cụ cạn, thờm thuốc thử Fehling ệ Xuất hiện tủa màu đỏ gạch ệ
Cú đường khử
+ Phần D5 thờm 6 lần thể tớch nước, chia 2 phần:
Phần 1: Thờm acid ệ Xuất hiện màu đỏ . Phần 2: Thờm kiềm ệ Xuất hiện màu xanh
Dung dịch E: chia làm 3 phần :
Phần 1: Kiềm húa (NH4OH loóng), lắc với ete, dịch chiết ete lắc với H2SO4 2%. Sau đú làm phản ứng với thuốc thử alcaloid
Phần 2: Làm phản ứng với thuốc thử Fehling ệ Xuất hiện kết tủa đỏ gạch ệ Cú đường khử
Phần 3: thờm Natri acetat (tinh thể) + FeCl3 ệ Xuất hiện màu xanh đen
ệ Cú tanin
- Định tớnh paclitaxel và baccatin III bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao, cú so sỏnh kết quả với cỏc chất chuẩn paclitaxel và baccatin III. Song song làm với mẫu thụng đỏ tự nhiờn.
* Định lượng cỏc hoạt chất trong sinh khối tế bào
Trong sinh khối thụng đỏ cú nhiều cỏc taxan. Tuy nhiờn, trong luận ỏn này nghiờn cứu phương phỏp định lượng paclitaxel và baccatin III là những hoạt chất chớnh cú ý nghĩa trong nghiờn cứu định lượng, xõy dựng TCCS, chiết xuất cũng như sử dụng vào việc khảo sỏt quy trỡnh nuụi cấy.
- Xõy dựng phương phỏp định lượng paclitaxel và baccatin III
Tiến hành xõy dựng phương phỏp định lượng paclitaxel và baccatin III bằng HPLC [21], [83], với cỏc điều kiện sau:
+ Detector PDA 228 nm.
+ Pha động : ACN – Nước (gradient). + Thể tớch tiờm mẫu: 20 àl.
+ Cột C18 (Phenyl Dynamax và Curosil – PFP).
Trong quỏ trỡnh xõy dựng và thẩm định phương phỏp định lượng tiến hành khảo sỏt cỏc yếu tố: phương phỏp chiết, cột, độ đặc hiệu và tớnh tương thớch của phương phỏp, khoảng tuyến tớnh, độ đỳng, độ ổn định.
- Định tớnh và định lượng paclitaxel và baccatin III trong sinh khối tế bào thụng đỏ bằng phương phỏp HPLC xõy dựng được.
2.2.2.2. Nghiờn cứu chiết xuất phõn lập và nhận dạng một số chất chớnh
trong sinh khối
* Chiết xuất, phõn lập
Sinh khối thụng đỏ khụ được xay nhỏ và chiết với methanol [75] bằng thiết bị chiết siờu õm. Dịch methanol của cỏc lần chiết gộp lại, lọc và cất loại dung mụi thu được cắn dịch methanol. Cắn này được hũa vào nước và chiết phõn đoạn lần lượt với cỏc dung mụi n-hexan, ethyl acetat và n-butanol, cất loại dung mụi thu được cỏc cắn tương ứng. Cỏc cắn được tiến hành phõn tỏch
thụ bằng sắc ký cột pha thuận (chất hấp phụ là silica gel) và cỏc phõn đoạn được tinh chế bằng sắc ký cột pha đảo (chất hấp phụ là YMC RP-18).
* Xỏc định cấu trỳc húa học
Cấu trỳc húa học của cỏc chất phõn lập được xỏc định dựa vào cỏc số liệu phổ tử ngoại (UV), phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhõn một chiều (1D NMR: 1H, 13C-NMR, cỏc phổ DEPT 90, DEPT 135) và hai chiều (2D NMR: HSQC, HMBC, COSY và NOESY), so sỏnh, đối chiếu với số liệu đó cụng bố trong cỏc tài liệu tham khảo.
2.2.2.3. Nghiờn cứu chiết xuất, tinh chế paclitaxel từ sinh khối tế bào thụng đỏ
Chiết xuất paclitaxel trong sinh khối tế bào thụng đỏ được tiến hành theo phương phỏp chiết bằng siờu õm [75]. Khi đó được dịch chiết tiến hành tinh chế qua 2 giai đoạn: giai đoạn tinh chế bằng thay đổi dung mụi hũa tan [71], [100], tiếp đú là tinh chế bằng sắc ký cột [120]. Cỏch tiến hành như sau:
* Chiết xuất paclitaxel
- Chiết giai đoạn 1: Khối tế bào được chiết nhiều lần bằng siờu õm với cỏc dung mụi theo tỷ lệ nhất định, sau đú được lọc chõn khụng thu dịch chiết. Gộp cỏc dịch chiết, cụ dưới ỏp suất giảm đến thể tớch dịch chiết cũn khoảng 30% ban đầu. Khảo sỏt lựa chọn dung mụi chiết xuất, số lần chiết để được hiệu suất cao nhất, thời gian chiết ngắn.
- Chiết giai đoạn 2: Dịch chiết cụ đặc ở giai đoạn 1 được chiết với dung mụi DCM. Chiết lặp lại ớt nhất 3 lần, dịch chiết thụ được gộp lại và cụ dưới ỏp suất giảm thu được cặn.
* Tinh chế sơ bộ paclitaxel
- Xử lý hấp phụ dịch thụ: Cặn thu được ở giai đoạn 2 được hũa tan trong dung mụi nhất định, loại tạp bằng than hoạt. Dịch chiết đó loại tạp và dịch rửa than hoạt được cụ dưới ỏp suất giảm tới tới cặn. Khảo sỏt tỷ lệ than hoạt xử lý hấp phụ.
- Kết tủa giai đoạn 1: Cặn được hũa tan lại trong DCM, thờm từ từ n- hexan vào, khuấy đều để yờn cho kết tủa. Lọc lấy kết tủa sấy khụ. Khảo sỏt
ảnh hưởng của hỗn hợp dung mụi tới hiệu suất và hàm lượng paclitaxel thu được.
* Tinh chế paclitaxel bằng sắc ký cột
- Tủa thu được ở giai đoạn trờn được hũa tan trong một lượng tối thiểu dung mụi chạy cột, sau đú cho chạy qua cột với cỏc điều kiện thớch hợp.
- Từ sắc ký, gộp cỏc phõn đoạn chứa paclitaxel, cụ bớt dung mụi, kết tinh lại paclitaxel bằng dung mụi thớch hợp. Kiểm tra độ tinh khiết bằng HPLC.
- Để đỏnh giỏ hiệu quả của mỗi giai đoạn trong quỏ trỡnh chiết xuất dựa vào cỏc chỉ tiờu sau:
+ Hiệu suất chiết của từng giai đoạn: là lượng paclitaxel chiết được trong sản phẩm so với lượng paclitaxel trong nguyờn liệu ban đầu đưa vào chiết của giai đoạn đú.
+ Hàm lượng paclitaxel trong sản phẩm thu được: là % paclitaxel chiết được so với khối lượng thu được ở mỗi giai đoạn chiết xuất hoặc tinh chế.
2.2.2.4. Phương phỏp xõy dựng TCCS của Thụng đỏ sinh khối
Xõy dựng TCCS của sinh khối tế bào thụng đỏ theo phương phỏp của DĐVN IV [1] và Dược điển Mỹ 30 [130] với cỏc chỉ tiờu sau:
- Hỡnh thức: kiểm tra bằng cảm quan
- Độ ẩm: Theo quy định của DĐVN IV, PL - 12.16. - Tro toàn phần: Theo quy định của DĐVN IV, PL – 9.8.
- Tro khụng tan trong acid: Theo quy định của DĐVN IV, PL – 9.7. - Định tớnh: paclitaxel và baccatin III bằng HPLC.
- Định lượng paclitaxel và baccatin III theo phương phỏp đó xỏc định ở mục 2.2.2.1.
2.2.2.5. Kiểm nghiệm chất lượng paclitaxel
- Tiến hành định lượng paclitaxel theo phương phỏp trong chuyờn luận paclitaxel trong USP 30.
2.2.3. Phương phỏp phõn tớch xử lý kết quả nghiờn cứu
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIấN CỨU