CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.2. CÔNG NGHỆ SINH KHỐI TẾ BÀO THỰC VẬT
1.3.2. Sản xuất paclitaxel bằng công nghệ sinh khối tế bào thực vật
Hiện nay công nghệ sinh khối tế bào thực vật đã áp dụng trong nghiên cứu và sản xuất paclitaxel từ các loài thông đỏ. Trong nhiều thập kỉ qua, các nghiên cứu về sinh tổng hợp paclitaxel và các dẫn chất bằng việc nuôi cấy tế bào các loài thông đỏ đã được tiến hành như T. brevifolia, T. baccata, T.
cuspidata, T. chinensis, T. canadensis, T. yunnanensis, T. x media. Trong đó điển hình là các nghiên cứu về con đường sinh tổng hợp hoạt chất cũng như các biện pháp nhằm cải thiện hàm lượng paclitaxel trong sinh khối như: tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy, sàng lọc các dòng tế bào có khả năng sinh hoạt chất cao, tối ưu hóa môi trường nuôi cấy, các biện pháp kích thích tăng sinh tổng hợp hoạt chất như sử dụng các chất kích thích sinh hoạt chất và các tiền chất, cũng như kỹ thuật nuôi hai pha, nuôi cấy hai giai đoạn và kỹ thuật bất động tế bào [119], [125].
1.3.2.1. Con đường sinh tổng hợp paclitaxel
Paclitaxel được hình thành chủ yếu từ nguyên liệu ban đầu là các phân tử geranylgeranyl diphosphat (GGPP) gồm nhiều giai đoạn [125] (hình 1.5).
Việc nghiên cứu tìm ra con đường sinh tổng hợp paclitaxel trong thông đỏ, góp phần cung cấp các hiểu biết về phản ứng cũng như các enzyme tham gia phản ứng. Từ đó giúp các nhà khoa học nghiên cứu các biện pháp kích
hoạt làm tăng sinh tổng hợp paclitaxel như: sử dụng tiền chất phenylalanine, sử dụng elicitor, các chất kích hoạt enzym [41], [125].
Hình 1.5. Con đường sinh tổng hợp của Paclitaxel
* Nguồn: Sonia M. (2011) [125]
1.3.2.2. Lựa chọn các dòng tế bào có khả năng sinh hoạt chất cao
Dòng tế bào là yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới quá trình sinh trưởng cũng như sinh tổng hợp các chất chuyển hóa thứ cấp. Đặc biệt, khi nuôi cấy trong môi trường lỏng, các tế bào có sự thay đổi đáng kể về hàm lượng hoạt chất khi nuôi cấy các dòng tế bào khác nhau. Điều này là do có sự khác biệt về gen dẫn đến sự khác biệt trong hoạt động sinh tổng hợp hoạt chất. Vì vậy, trong quá trình nghiên cứu phải tạo ra được những dòng tế bào phát triển nhanh có khả năng tạo hoạt chất với hàm lượng cao. Bunakova và cs [30] khi nghiên cứu nuôi cấy 9 dòng dòng tế bào T. baccata khác nhau thì chỉ có một dũng cho thấy sự cải thiện sản lượng (23,2 àg/g khối lượng khụ). Trong một nghiên cứu khác của cùng một nhóm, dòng tế bào được Brunakova lựa chọn và nhân bản vô tính sau 20 tháng kích hoạt tạo callus, hàm lượng paclitaxel trong tế bào đạt tới 0,0109% [31].
1.3.2.3. Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy
Thành phần môi trường nuôi cấy là yếu tố tác động và ảnh hưởng trực tiếp tới tốc độ sinh trưởng cũng như khả năng sinh tổng hợp hoạt chất. Trong nuôi cấy các loại thông đỏ, 2 môi trường thường được sử dụng là SH và B5.
Tuy nhiên, các thành phần thường được thay đổi để tốc độ phát triển của tế bào tốt nhất, hàm lượng hoạt chất cao nhất. Các thành phần này thường là:
* Nguồn hydratcarbon
Hydratcarbon không chỉ ảnh hưởng đến tốc độ phát triển của tế bào, mà còn ảnh hưởng đến các con đường sinh tổng hợp các sản phẩm chuyển hóa thứ cấp. Bởi hydratcarbon trong môi trường tạo ra áp suất thẩm thấu. Khi áp suất thẩm thấu tăng, tác động vào tế bào, sẽ làm tăng tổng hợp các phytoalexin, những chất này sẽ kích thích sản xuất các sản phẩm thứ cấp [72], [97], [60].
* Các hormon thực vật
Hormon thực vật hoặc chất kích thích sinh trưởng là chất rất cần thiết đối với sự phát triển cũng như biệt hóa của các dòng tế bào, đặc biệt là khi tế
bào đã tách ra khỏi cơ thể ban đầu. Trong nuôi cấy sinh khối tế bào thông đỏ, thường sử dụng 2 nhóm chất kích thích sinh trưởng chính là auxin (NAA; 2,4- D; 2,4,5-T, picloram) và cytokinin (kinetin, BAP). Thông thường, 2 nhóm chất này được sử dụng kết hợp với nhau. Các hormon thực vật được sử dụng với nồng độ cao ở giai đoạn pha phát triển với mục đích tăng sinh tế bào. Tuy nhiên, khi chuyển sang môi trường nuôi cấy để sản xuất hoạt chất, thì hàm lượng các hormon thực vật sử dụng với nồng độ thấp hơn [27], [72].
* Các chất kích thích sinh tổng hợp hoạt chất (elicitor)
Chất kích thích tăng hoạt chất đã được sử dụng như một chất quan trọng trong việc tăng hàm lượng paclitaxel và các dẫn chất trong nuôi cấy tế bào của các loài thông đỏ. Một số loại elicitor đã được sử dụng như: dịch chiết tế bào của các loài vi khuẩn (Penicillium minioluteum, Botrytis cinerea, Verticillium dahlliae, Gilocladium delicquecesens); chitosan glutamate; lichenan; các polysaccharid phức hợp từ thành tế bào vi khuẩn, các acid ferulic, arachidonic và benzoic; các elicitor vô sinh như: La+3, V+2, Co+2, Ag+ [119]. Trong đó, acid jasmonic và dẫn chất (methyl jasmonat, ethyl jasmonat) đã được chứng minh là một chất đóng vai trò quan trọng trong quá trình dẫn truyền các tín hiệu điều chỉnh gen tham gia vào quá trình sinh tổng hợp hoạt chất [102]. Vì vậy, các chất này đã được sử dụng rất phổ biến và hiệu quả trong việc tăng sinh hoạt chất. Y.
Yukimune và cs [144] thờm 100 àM MJ vào ngày thứ 14 của chu kỳ nuụi cấy tế bào T. baccata. Kết quả, hàm lượng paclitaxel tăng từ 0,4 mg/l lên 48,3 mg/l và baccatin III tăng từ 0,4 mg/l lên 53,6 mg/l so với nhóm chứng. Nghiên cứu của Wang [135] ở loài T. chinensis cho thấy, khi thờm 100 àM MJ vào ngày thứ 7, thì sau 14 ngày nuôi cấy, tất cả các hoạt chất đều tăng hơn so với nhóm không dựng MJ (paclitaxel tăng từ 412 àg/g lờn 3,153 àg/g, bacatin III từ 7 àg/g lờn 69 àg/g, 10-deacetyl baccatin III từ 203 àg/g lờn 456 àg/g).
* Tiền chất (precursor)
Một chiến lược trong việc tăng sinh hoạt chất là sử dụng các tiền chất trong quá trình nuôi cấy, giúp làm giảm thời gian sinh tổng hợp các hoạt chất.
Tuy nhiên, việc bổ sung tiền chất phải dựa trên hiểu biết về con đường sinh tổng hợp của hoạt chất đó. Với paclitaxel, quá trình sinh tổng hợp bắt đầu từ các phân tử isopentenyl diphosphat trải qua nhiều phản ứng trung gian để tạo ra khung cơ bản taxan (10-deacetyl baccatin III, baccatin III) trước khi phản ứng với phenylalanin dạng Coenzyme A để tạo ra cấu trúc cơ bản của paclitaxel (hình 1.5) [125]. Vì vậy, các nhà khoa học đã bổ sung tiền chất phenylalanin vào môi trường nuôi cấy, nhằm tăng nhanh việc hình thành sản phẩm paclitaxel. Khi nuôi cấy loài T. baccata, người ta đã bổ sung phenylalanin kết hợp với sử dụng AgNO3, VSO4, CoCl2 để kích thích tăng sinh tổng hợp hoạt chất. Kết quả, hàm lượng paclitaxel cao hơn gấp 5-6 lần (13,75 mg/l) so với nhóm chứng (2,5 mg/l) [72].
1.3.2.4. Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy
Trong việc tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy, thường sử dụng các chiến lược nhằm tăng sinh hoạt chất cho tế bào. Các chiến lược đó bao gồm:
* Nuôi cấy 2 giai đoạn (two stage culture system)
Quá trình phát triển của tế bào trải qua 4 giai đoạn khác nhau: giai đoạn thích nghi, giai đoạn phát triển, giai đoạn ổn định và giai đoạn suy tàn. Trong đó, giai đoạn phát triển là giai đoạn tế bào tăng sinh nhanh, tạo ra khối lượng lớn tế bào; còn giai đoạn ổn định diễn ra quá trình sinh tổng hợp hoạt chất. Vì vậy, hiện nay người ta đã sử dụng hệ thống nuôi cấy 2 giai đoạn, với 2 môi trường khác nhau cho giai đoạn phát triển và giai đoạn ổn định. Trước hết, cần tạo được môi trường thuận lợi ở giai đoạn phát triển, để tế bào phát triển tốt nhất, thu được khối lượng tế bào cao nhất. Khi tế bào chuyển sang giai đoạn ổn định, sẽ chuyển sang môi trường mới, giúp duy trì và kéo dài giai đoạn ổn định, nhằm làm cho quá trình sinh tổng hợp hoạt chất được kéo dài hơn. Ngoài ra, trong giai đoạn này có thể bổ sung các tiền chất và các elicitor góp phần kích thích tăng sinh tổng hợp hoạt chất ở mức cao nhất. Chiến lược này đã được sử dụng thành công để cải thiện việc sản xuất paclitaxel và baccatin III khi nuôi cấy các loài thông đỏ trong môi trường lỏng. Khi nuôi
cấy dòng tế bào T. baccata, J. Palazon và cs [108] đã sử dụng môi trường B5 có bổ sung saccharose (0,5%), fructose (0,5%), NAA (2,0 mg/l), BAP (0,1 mg/l) giúp tăng trưởng, sau đó chuyển giao môi trường saccharose 3%, picloram 2,0 mg/l và kinetin 0,1 mg/l, để tạo thành paclitaxel và baccatin III.
Kết quả, hàm lượng paclitaxel đạt 1,58 mg/l, baccatin III đạt 0,32 mg/l, cao hơn so với khi sử dụng một loại môi trường.
* Nuôi cấy 2 pha (two phase culture):
Nuôi cấy 2 pha là sử dụng thêm pha không tan trong môi trường nuôi cấy, nhằm hấp phụ các chất chuyển hóa sinh ra trong quá trình nuôi cấy, mà các chất này thông thường có tác dụng ức chế ngược quá trình sinh trưởng cũng như tổng hợp hoạt chất. Hệ thống nuôi cấy 2 pha đã ứng dụng thành công trong sản xuất sinh khối tế bào thông đỏ. Trong đó, pha thứ 2 có thể dùng là chất rắn hấp phụ hoặc dung môi không đồng tan với môi trường. Tuy nhiên, các chất rắn có nhiều ưu điểm hơn và hay được sử dụng hơn. Kwon và cs [80] đã bổ sung Amberlite XAD không ion (một dạng polymer không tan trong nước) vào ngày thứ 16 trong chu kỳ nuôi cấy tế bào T. cuspidata. Kết quả, hàm lượng paclitaxel thu được tăng lên 40-70%. Ngoài sử dụng chất rắn hấp phụ, người ta còn sử dụng chất lỏng hữu cơ như dibutyl phthalat, glycerol, dầu silicon, ether, parafin,… Tuy nhiên, việc bổ sung các chất lỏng hữu cơ có thể gây độc và làm chết tế bào. Vì vậy, cần phải nghiên cứu đầy đủ về độc tính, cách sử dụng để thu được hiệu quả tốt nhất.
* Bất động tế bào (Immobilization)
Bất động tế bào là quá trình làm giảm sự chuyển động của tế bào trong môi trường nuôi cấy. Khi bất động tế bào sẽ làm mật độ tế bào cao hơn, khả năng tiếp xúc tế bào – tế bào tăng, bảo vệ được tế bào dưới chuyển động của dòng môi trường khi khuấy trộn và ngăn ngừa rửa trôi tế bào trong khi vận hành liên tục. Với những ưu điểm này, bất động tế bào đã làm tăng quá trình sinh tổng hợp hoạt chất, tế bào phát triển tốt hơn [29]. Để tạo ra sự bất động tế bào, người ta sử dụng các chất tạo gel khác nhau như alginat, carrageenan,
polyacrylamid, agarose, polyurethan,… Trong nuôi cấy tế bào T. baccata, Bentebibel và cs [23] đã sử dụng calci alginat để làm bất động các tế bào trong sản xuất paclitaxel và baccatin III. Kết quả cho thấy, sự bất động tế bào đã nâng cao hàm lượng hoạt chất từ 2-3 lần so với nuôi cấy tế bào không làm bất động. Tuy nhiên, quá trình này còn phụ thuộc vào loại chất cũng như nồng độ chất tạo gel cho vào môi trường nuôi cấy. Khi sử dụng alginat ở các nồng độ 1,5%, 2% và 2,5% thì hàm lượng paclitaxel lần lượt đạt là 13,20 mg/l, 10,85 mg/l và 11,90 mg/l; còn hàm lượng baccatin III đạt tối đa 4,62 mg/l khi sử dụng alginat 2,5%.
Ngoài ra, trong quá trình nuôi cấy tế bào còn phải khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố khác như nhiệt độ nuôi cấy, nồng độ khí hòa tan, thời gian một chu kỳ nuôi cấy, pH môi trường nuôi cấy cũng như các biện pháp kích hoạt gen để tăng sinh tổng hợp hoạt chất.
1.3.3. Phương pháp định lượng paclitaxel và các dẫn chất sử dụng trong