Kromasil C18 (250ì4,6 mm; 5 àm), detector PDA mảng diod, với hệ pha động CH3OH-H2O (65:35, tt/tt) để định lượng paclitaxel, baccatin III và cephalomanlin trong sinh khối. Một số nghiờn cứu khỏc sử dụng cột chiết pha rắn để loại tạp chất trong mẫu trước khi định lượng [25]. Pha động hay sử dụng để định lượng paclitaxel và cỏc dẫn chất taxan thường là hỗn hợp MeOH, ACN và nước cất với chế độ gradient [54].
1.3.4. Cỏc phương phỏp chiết xuất phõn lập paclitaxel từ sinh khối tế bào thụng đỏ thụng đỏ
Việc chiết xuất paclitaxel trong sinh khối tế bào thụng đỏ thường gặp nhiều khú khăn do trong thành phần húa học cú chứa nhiều chất cú cấu trỳc húa học gần giống nhau. Vỡ vậy, để tinh chế đạt tiờu chuẩn dược dụng (>97%) phải sử dụng cỏc phương phỏp tinh chế đắt tiền như: sắc ký cột, sắc ký điều chế, do đú tốn thời gian cũng như dung mụi húa chất và hiệu suất thu được thấp [75]. Cho đến nay đó cú nhiều tỏc giả đó nghiờn cứu đưa ra cỏc phương phỏp đơn giản, ớt tốn kộm hơn để tinh chế paclitaxel chiết xuất từ sinh khối tế bào [43], [62], [66], [113].
Thụng thường paclitaxel được chiết xuất trong sinh khối bằng cỏc dung mụi hữu cơ như: methanol, hexan, cloroform, aceton… trong đú methanol tỏ ra là dung mụi cú hiệu quả nhất (hiệu suất >95%, hàm lượng paclitaxel đạt 0,5%). Sau khi thu được dịch chiết thụ tiến hành giai đoạn tinh chế sơ bộ bằng nhiều phương phỏp khỏc nhau, trong đú cú xử lý hấp phụ bằng than hoạt tớnh, đất sột hoạt tớnh. Đặc biệt, nghiờn cứu tinh chế dựa vào nguyờn lý kết tinh phõn đoạn và kết tủa dựa vào sự thay đổi độ tan của paclitaxel trong cỏc dung mụi khỏc nhau. Cỏc tỏc giả đó đề ra được phương phỏp tinh chế mới đơn giản hơn và độ tinh khiết thu được của sản phẩm đó được cải thiện đỏng kể. Kim và cs [75] nghiờn cứu về phương phỏp tinh chế paclitaxel từ sinh khối, bằng cỏch xử lý dịch chiết xuất với cỏc chất hấp phụ khỏc nhau và sử dụng 2 hỗn hợp dung mụi ở 2 giai đoạn kết tủa khỏc nhau. Kết quả đó lựa chọn được chất
hấp phụ tối ưu là đất sột hoạt tớnh với tỷ lệ là 50% (kl/kl) ở nhiệt độ 400C, lựa chọn được hỗn hợp dung mụi DCM : n-hexan cho giai đoạn kết tủa 1 với hiệu suất thu được >95% và độ tinh khiết của sản phẩm >25%. Ở kết tủa giai đoạn 2 hỗn hợp dung mụi MeOH : H2O cho sản phẩm cú độ tinh khiết >65% và hiệu suất là >85%. Ngoài ra nhiều tỏc giả cũng nghiờn cứu cỏc điều kiện ảnh hưởng tới quỏ trỡnh tinh chế bằng hỗn hợp dung mụi, kết tinh phõn đoạn như: nhiệt độ kết tinh, thời gian kết tinh, pH dung mụi, điều kiện khuấy trộn… [43], [62], [63], [66].
Một phương phỏp khỏc trong nghiờn cứu tinh chế paclitaxel là sử dụng chất tạo mixen gắn hoạt chất vào phần giữa của cấu trỳc mixen, sau đú chiết paclitaxel ra khỏi mixen bằng dung mụi hữu cơ và thực hiện tiếp giai đoạn kết tủa bằng hỗn hợp dung mụi. Kim và cs [74] đó sử dụng phương phỏp tinh chế ban đầu paclitaxel bằng tạo ra mixen sau đú tiếp tục tinh chế bằng kết tủa phõn đoạn. Kết quả nghiờn cho thấy chiết paclitaxel từ sinh khối bằng dung mụi MeOH, sau 4 lần cho hiệu suất là 99%. Khi chuyển dịch chiết paclitaxel thụ vào chất lỏng N-cetylpyridin chlorid (chất tạo mixen), sau đú chiết với MtBE (methyl t-butyl ether), dịch chiết sẽ được kết tủa với hexan thỡ hiệu suất thu được là 80% với độ tinh khiết của paclitaxel đạt 65,8%.
Như vậy cú thể thấy rằng quỏ trỡnh chiết xuất phõn lập paclitaxel từ sinh khối tế bào thụng đỏ đó được nghiờn cứu rất nhiều, trong đú đặc biệt chỳ ý đến cỏc điều kiện của giai đoạn tinh chế nhằm làm tăng độ tinh khiết của sản phẩm trước khi sử dụng cỏc biện phỏp tinh chế đặc biệt khỏc như HPLC, sắc ký cột... để thu được paclitaxel đạt tiờu chuẩn dược dụng.
CHƯƠNG 2
NGUYấN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU 2.1. NGUYấN LIỆU, HểA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIấN CỨU 2.1.1. Nguyờn liệu và hoỏ chất
- Mẫu cành non cõy thụng đỏ 10 tuổi (Taxus wallichiana Zucc.) thu thập tại Đà Lạt, Lõm Đồng vào thỏng 4 năm 2008. Được Viện Sinh thỏi tài nguyờn sinh vật -Viện khoa học cụng nghệ VN thẩm định (xem phụ lục 1).
- Cỏc húa chất dựng để pha chế mụi trường nuụi cấy của hóng Sigma đạt tiờu chuẩn cho nuụi cấy tế bào thực vật. Cỏc chất chuẩn paclitaxel (99,98%), baccatin III (99,78%), acid 1-naphtalen acetic (99,95%), 6-benzyl amino purin (99,81%) của Sigma.
- Cỏc hoỏ chất dựng trong chiết xuất, phõn lập, phõn tớch kiểm nghiệm của Merck.
2.1.2. Thiết bị nghiờn cứu
- Hệ thống phũng thớ nghiệm đạt tiờu chuẩn vụ khuẩn dựng cho nuụi cấy tế bào của Học viện Quõn y.
- Tủ nuụi cấy vi sinh, model LHC – 4A1 (hóng Esco – Singapo). - Hệ thống mỏy lắc, model: ISF-4-W (Hóng Kuhner – Thụy Sĩ). - Tủ tạo khụng khớ sạch -Lamine (Narie – Đức).
- Mỏy hấp tiệt trựng Hirayama – model HV-110 (Nhật).
- Mỏy sắc ký lỏng hịờu năng cao detector PDA - UV 2 kờnh Gradient(Waters): 2695D, buồng gia nhiệt, hệ thống bơm mẫu tự động.
- Mỏy lắc siờu õm (Soniclean 500 UT).
- Mỏy cất nước 2 lần Hamilton WSC 14D (Đức).
- Mỏy ly tõm tốc độ 30.000 vũng/phỳt (Universal 320) (Đức). - Mỏy cất quay chõn khụng Tokyo Rikakikai model N-100 (Nhật) - Tủ ấm 37oC (Mỹ).
- Mỏy ly tõm lạnh tốc độ 20.000 vũng/phỳt, model MikRo 22R (Hettich, Đức).
- Thiết bị chiết siờu õm gia nhiệt Memmert GmbH + Co.KG D-91126 Schwabach FRG (Đức).
- Mỏy Fraction collector DC-1200 (Nhật).
- Mỏy đo nhiệt độ núng chảy Boetus-HMK (Đức). - Mỏy đo năng suất quay cực JASCO DIP-370 (Nhật). - Mỏy quang phổ UV Speccord 40 (Đức).
- Mỏy quang phổ IR Hitachi-730-30 (Nhật).
- Mỏy đo phổ khối LC-MSD Agilent 6310 Ion Trap (Mỹ).
- Mỏy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhõn Bruker Avance 500 (Đức).
- Sắc ký cột: chất nhồi cột loại pha thuận là silica gel cỡ hạt 70–230 mesh (40-63 μm) và 230–400 mesh (63 – 200 μm) (Merck); chất nhồi cột loại pha đảo là YMC RP-18 resin cỡ hạt 30–50 μm (Fuji Silysia Chemical Ltd.).
- Cõn phõn tớch Satorius độ chớnh xỏc 0,1g và 0,01 mg (Đức).
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
2.2.1. Xõy dựng qui trỡnh tạo sinh khối thụng đỏ
Quy trỡnh tạo sinh khối tế bào thụng đỏ được tiến hành theo cỏc nguyờn tắc của Enaksha, Parc, Cusido [42], [48], [120]. Cành non thụng đỏ được xử lý tiệt khuẩn, cắt thành lỏt nhỏ, cấy vào mụi trường thạch để tạo callus. Sau khi tạo thành, callus sẽ được duy trỡ nuụi cấy trong mụi trường thạch. Quỏ trỡnh nuụi cấy tạo và duy trỡ callus trong mụi trường thạch cần phải xỏc định được mụi trường, thời gian, nhiệt độ, pH, nồng độ chất kớch thớch sinh trưởng phự hợp. Sau đú, cấy chuyển tế bào sang mụi trường lỏng cú sử dụng mỏy lắc. Ở giai đoạn này, cần xỏc định thời gian, pH, nhiệt độ, chất kớch thớch sinh trưởng phự hợp cho sinh khối thụng đỏ phỏt triển. Đồng thời, cần xỏc định được loại, nồng độ, thời điểm cho tiếp xỳc, thời gian tiếp xỳc với chất kớch thớch làm tăng hoạt chất. Sau khi đó xỏc định được mụi trường và điều kiện nuụi cấy tốt nhất, phỏt triển qui mụ nuụi cấy lờn hệ thống bỡnh nuụi cấy với cỏc điều kiện như trong mụi trường lỏng. Thu hoạch sinh khối nghiờn cứu
thành phần húa học, chiết xuất, phõn lập và nhận dạng cỏc hoạt chất, xõy dựng tiờu chuẩn cơ sở của nguyờn liệu và hoạt chất.
2.2.1.1. Nuụi cấy tạo callus thụng đỏ
Nuụi cấy callus thụng đỏ được tiến hành theo phương phỏp của Enaksha và cs [48] gồm cỏc bước cơ bản sau:
- Chuẩn bị mụi trường nuụi cấy. - Vụ trựng mẫu cấy.
- Tỏch cỏc mụ ra khỏi mẫu cấy.
- Cấy mẫu vào mụi trường nuụi cấy khảo sỏt.
- Nuụi cấy trong mụi trường thạch ở điều kiện vụ khuẩn và khụng cú ỏnh sỏng.
Đỏnh giỏ: khảo sỏt khả năng tạo callus trờn cỏc mụi trường khỏc nhau dựa trờn cỏc chỉ tiờu:
+ Hỡnh thỏi của callus: tế bào phỏt triển đều, sỏng màu, khụng bị nhiễm nấm mốc.
+ Khối lượng callus khụ.
Để xõy dựng quy trỡnh nuụi cấy tạo callus thụng đỏ, khảo sỏt cỏc thụng số sau:
- Khảo sỏt lựa chọn chất sỏt khuẩn mẫu tự nhiờn
- Khảo sỏt thời gian tiệt khuẩn mẫu
- Khảo sỏt lựa chọn mụi trường nuụi cấy tạo callus thụng đỏ - Khảo sỏt ảnh hưởng của thời gian nuụi cấy
- Khảo sỏt ảnh hưởng của chất kớch thớch sinh trưởng
2.2.1.2. Duy trỡ nuụi cấy callus trong mụi trường thạch.
Callus sau khi tạo được trong mụi trường thớch hợp, tiến hành cấy chuyển trong mụi trường thạch nhằm mục đớch cho tế bào phỏt triển nhanh, thớch nghi với mụi trường, đồng thời hạn chế quỏ trỡnh biệt húa của tế bào mụ, cỏc tổ chức [48], [52]. Cỏc bước tiến hành gồm:
- Cấy callus vào trong mụi trường.
- Nuụi cấy trong điều kiện vụ khuẩn, khụng ỏnh sỏng ở nhiệt độ thớch hợp. Sau từng khoảng thời gian nhất định lấy mẫu ra kiểm tra và đỏnh giỏ theo cỏc chỉ tiờu.
* Cỏc chỉ tiờu đỏnh giỏ: Hỡnh thức tế bào, khối lượng tế bào khụ, tỷ lệ tăng trưởng (là tỷ lệ giữa khối lượng (g) tế bào khụ thu hoạch trờn khối lượng (g) tế bào đưa vào nuụi cấy ban đầu).
Trong giai đoạn này, tiến hành khảo sỏt cỏc yếu tố ảnh hưởng tới sự phỏt triển của callus và khả năng biệt húa [38], [90], [102] bao gồm:
- Đỏnh giỏ sự thớch nghi của callus thụng đỏ trong mụi trường thạch - Khảo sỏt ảnh hưởng của nồng độ saccharose
- Khảo sỏt ảnh hưởng của nhiệt độ nuụi cấy
- Khảo sỏt ảnh hưởng của pH mụi trường nuụi cấy
2.2.1.3. Nghiờn cứu nuụi cấy tế bào thụng đỏ trong mụi trường lỏng
Nuụi cấy sinh khối tế bào thụng đỏ trong mụi trường lỏng dựa theo phương phỏp mụ tả của Khosroushahi và Yan [72], [138].
- Chuẩn bị mụi trường lỏng để nuụi cấy
- Cấy tế bào vào mụi trường lỏng với tỷ lệ nhất định. - Nuụi trong điều kiện vụ khuẩn, khụng cú ỏnh sỏng.
- Sau khoảng thời gian nuụi cấy, tiến hành thu hoạch tế bào, rửa sạch, sấy khụ, đỏnh giỏ cỏc chỉ tiờu.
* Cỏc chỉ tiờu đỏnh giỏ: khối lượng tế bào thụng đỏ khụ (sấy khụ tế bào thụng đỏ ở 450C đến khối lượng khụng đổi). Qui đổi số gam tế bào khụ trong 1 lớt mụi trường (g/l); tỷ lệ sinh trưởng (khối lượng tế bào khụ thu được sau khi nuụi cấy so với khối lượng tế bào cho vào ban đầu).
Trong giai đoạn này, khảo sỏt ảnh hưởng của một số yếu tố đến tốc độ phỏt triển cũng như hàm lượng hoạt chất trong tế bào:
- Đỏnh giỏ khả năng thớch nghi của tế bào thụng đỏ trong mụi trường lỏng
- Khảo sỏt ảnh hưởng của thời gian nuụi cấy đến sự phỏt triển của tế bào trong mụi trường lỏng
- Khảo sỏt ảnh hưởng của tỷ lệ mẫu cấy đến sự phỏt triển của tế bào thụng đỏ trong mụi trường lỏng
- Khảo sỏt ảnh hưởng của pH mụi trường nuụi cấy đến sự phỏt triển khối tế bào thụng đỏ
- Khảo sỏt ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phỏt triển tế bào thụng đỏ - Khảo sỏt lựa chọn chất kớch thớch sinh trưởng thớch hợp để nuụi cấy tế bào thụng đỏ trong mụi trường lỏng: lựa chọn loại chất kớch thớch sinh trưởng; lựa chọn nồng độ chất kớch thớch sinh trưởng thớch hợp
2.2.1.4. Nghiờn cứu ảnh hưởng của chất kớch thớch sinh tổng hợp hoạt chất
trong nuụi cấy tế bào thụng đỏ
Khảo sỏt cỏc chất kớch thớch sinh tổng hợp hoạt chất (elicitor) trong nuụi cấy tế bào thụng đỏ được tiến hành theo phương phỏp của Luo và Moon [90], [97].
- Chuẩn bị mụi trường nuụi cấy
- Cấy tế bào vào mụi trường, nuụi cấy trong điều kiện xỏc định
- Bổ sung elicitor vào mụi trường nuụi cấy ở thời điểm nhất định, tiếp tục nuụi cấy
- Sau khoảng thời gian nuụi cấy, tiến hành thu hoạch tế bào, rửa sạch, sấy khụ, đỏnh giỏ cỏc chỉ tiờu:
- Chỉ tiờu đỏnh giỏ: khối lượng tế bào khụ (g/l) và hàm lượng hoạt chất chớnh paclitaxel trong tế bào.
- Định lượng paclitaxel trong sinh khối bằng phương phỏp sắc ký lỏng hiệu năng cao (phương phỏp định lượng đó được nghiờn cứu xõy dựng và thẩm định, sẽ trỡnh bày ở phần sau của luận ỏn)
Trong quỏ trỡnh nghiờn cứu, khảo sỏt cỏc yếu tố ảnh hưởng tới tốc độ phỏt triển tế bào và hàm lượng paclitaxel [50], [72], [91], [146] gồm:
- Khảo sỏt lựa chọn nồng độ chất kớch thớch sinh tổng hợp hoạt chất trong sinh khối tế bào thụng đỏ
- Khảo sỏt thời điểm cho tế bào thụng đỏ tiếp xỳc với elicitor - Khảo sỏt lựa chọn thời gian cho tế bào tiếp xỳc với elicitor
- Khảo sỏt kết hợp bổ sung đường vào giữa chu kỳ nuụi cấy với elicitor - Khảo sỏt ảnh hưởng của nồng độ đường bổ sung giữa chu kỳ nuụi cấy.
2.2.1.5. Nuụi cấy trờn hệ thống bỡnh nuụi cấy 5 lớt
Sau khi đó khảo sỏt lựa chọn được cỏc điều kiện nuụi cấy, cũng như thành phần mụi trường cho nuụi cấy tế bào thụng đỏ, tiến hành cấy chuyển cỏc tế bào từ cỏc bỡnh nún trờn mỏy lắc như trờn sang hệ thống bỡnh nuụi cấy 5 lớt [141]. Sau thời gian nuụi cấy xỏc định, bổ sung thờm đường và elicitor thớch hợp. Khi kết thỳc chu kỳ nuụi cấy, thu hoạch tế bào. Xỏc định khối lượng tế bào, tỷ lệ tăng trưởng và hàm lượng paclitaxel trong tế bào và ngoài mụi trường.
2.2.1.6. Thu hoạch sinh khối thụng đỏ
Thu hoạch hỗn hợp gồm tế bào và mụi trường, lọc qua giấy lọc, thu lấy sinh khối. Sinh khối được rửa sạch với nước cất. Sau đú, sinh khối được sấy khụ tới khối lượng khụng đổi [7]. Xỏc định hàm lượng paclitaxel và cỏc chất kớch thớch sinh trưởng tồn dư (NAA và BAP) trong cỏc mẫu bằng HPLC [4], [88], [129], đúng tỳi bảo quản.
2.2.2. Nghiờn cứu thành phần hoỏ học và chiết xuất phõn lập một số chất chớnh, xõy dựng TCCS của nguyờn liệu sinh khối tế bào thụng đỏ chớnh, xõy dựng TCCS của nguyờn liệu sinh khối tế bào thụng đỏ
2.2.2.1. Nghiờn cứu định tớnh và định lượng hoạt chất trong sinh khối tế
bào thụng đỏ
* Định tớnh cỏc nhúm hợp chất trong sinh khối
Tiến hành bằng cỏc phản ứng húa học đặc trưng theo quy trỡnh về phương phỏp nghiờn cứu cõy thuốc [15] được mụ tả theo sơ đồ hỡnh 2.1. Cỏc dung dịch chiết xuất được sử dụng để làm cỏc phản ứng gồm: Dung dịch A: chia làm 3 phần:
Phần 1: Thờm dd KOH ệXuất hiện màu đỏ ệ Cú anthraquinon Phần 2: Thờm HCl + Mg ệ Xuất hiện màu đỏ ệCú flavonoid Phần 3: Bốc hơi ệCú cặn mỡ bộo ệ Cú acid bộo
Hỡnh 2.1. Sơđồ quy trỡnh chiết xuất SKTB thụng đỏ làm phản ứng định tớnh
Dung dịch B: chia làm 5 phần, thử với thuốc thử chung của alcaloid + Phần 1: Phản ứng với thuốc thử Mayer
+ Phần 2: Phản ứng với thuốc thử Bouchardat + Phần 3: Phản ứng với thuốc thử Bertrand
+ Phần 4: Phản ứng với thuốc thử acid picric bóo hoà. + Phần 5: Phản ứng với thuốc thử Dragendorff.
Dung dịch C: chia làm 3 phần, cụ cạn:
+ Phần 1: Thờm dd H2SO4 ệ Xuất hiện màu xanh da trời ệ Cú caroten
Bột dược liệu
Bó dược liệu Dịch chiết ether
Dd kiềm Dịch chiết ether Dịch chiết alcol Bó dược liệu
Dd alcol Dd H2SO40,2% Dịch chiết ether Dịch chiết acid Bó dược liệu
+ Ether
Acid hoỏ Lọc thu tủa Hoà tan trong alcol
+ Alcol 900 + KOH 10% + HCl 1%, t0s (Dung dịch D) + H2SO4 0,2% Rửa bằng nước
+ Phần 2: Làm phản ứng Libermann ệ Xuất hiện màu tớm đỏ ệ Cú phytosterol
+ Phần 3: Cụ bốc hơi ệ Cú mựi thơm ệ Cú tinh dầu Dung dịch D chia làm 5 phần :
+ Phần D1: Thờm 4 lần thể tớch nước, kiềm hoỏ (dd KOH 10%), lọc thu cắn dịch lọc để riờng.
Cắn: Làm phản ứng Libermann ệ vũng trũn màu xanh lục ệ Cú sterol