CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. XÂY DỰNG QUY TRÌNH TẠO SINH KHỐI TẾ BÀO THÔNG ĐỎ
3.1.3. Kết quả nuôi cấy trong môi trường lỏng
Sau khi callus thông đỏ được nuôi cấy trong môi trường thạch mềm, tế bào đã mềm mại, xốp, màu sắc tươi sáng và không còn khả năng biệt hóa được cấy chuyển sang môi trường lỏng trên hệ thống bình lắc (shaker). Quá trình cấy chuyển sang môi trường lỏng SH được tiến hành trong điều kiện vô khuẩn. Nuôi cấy tế bào trong bình nón dung tích 250 ml (thể tích môi trường
50 ml) điều kiện không có ánh sáng, tốc độ lắc 130 vòng/phút. Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố tới tốc độ phát triển của tế bào cũng như hàm lượng hoạt chất.
3.1.3.1. Kết quả đánh giá khả năng thích nghi của tế bào
Với mục đích tạo được khối tế bào thích nghi và phát triển tốt, ổn định trong môi trường lỏng SH, tiến hành cấy chuyển khoảng 10 g callus từ môi trường thạch SH sang môi trường lỏng SH có bổ sung NAA (2,0 mg/l), BAP (1,0 mg/l), saccharose (20 g/l), pH = 5,6, nhiệt độ 240C. Duy trì nuôi cấy trong thời gian 14 ngày, cứ sau 14 ngày lại cấy chuyển sang môi trường mới. Sau các lần cấy chuyển cân xác định khối lượng tế bào khô, tốc độ phát triển cũng như quan sát hình thái tế bào. Kết quả được trình bày trong bảng 3.13 và hình 3.6.
Hình 3.6. Hình ảnh tế bào thông đỏ qua các lần cấy chuyển
a: Cấy lần thứ 1 b: Cấy lần thứ 2 c: Cấy lần thứ 3 Bảng 3.13: Ảnh hưởng của số lần cấy chuyển tới tốc độ phát triển của tế bào
Lần cấy chuyển (n=10)
Khối lượng tế bào (g) (X ± SD)
Tỷ lệ tăng trưởng
(lần) p
1 15,44±1,16 1,51±0,11 p3-1< 0,05 2 21,93±1,05 2,20±0,10 p3-2< 0,05
3 28,25±1,32 2,83±0,13 *
4 28,90±1,27 2,89±0,12 p3-4> 0,05 5 29,27±1,44 2,92±0,14 p3-5> 0,05 Kết quả ở bảng 3.13 và hình 3.6 cho thấy: ở các lần cấy chuyển thứ 2 và thứ 3, tốc độ phát triển của tế bào tăng hơn so với các lần trước (p<0,05).
b c
a
Tuy nhiên, tốc độ phát triển của tế bào tăng thêm không đáng kể (p>0,05) khi cấy chuyển đến lần thứ 4 và thứ 5. Về hình thái tế bào: ở các lần cấy chuyển thứ 1 và thứ 2 phát triển chậm màu sắc đậm hơn. Tuy nhiên, khi cấy chuyển sang lần thứ 3, 4 thì tế bào phát triển nhanh, xốp, các tế bào sáng hơn.
3.1.3.2. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy
Từ kết quả nuôi cấy trong môi trường thạch, lựa chọn môi trường lỏng SH có bổ sung NAA (2,0 mg/l), BAP (1,0 mg/l), saccharose (20 g/l), pH
= 5,6 để khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy khi cấy chuyển sang môi trường lỏng. Sau ngày thứ 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 thu hoạch tế bào, sấy khô, xác định khối lượng tế bào. Kết quả được thể hiện ở hình 3.7.
Biểu đồ khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy
0 5 10 15 20 25 30
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
Th i g ian nuôi c y (ng ày)
Khối lượng tế bào tươi (g)
K L khô
Hình 3.7. Đồ thị biểu diễn khối lượng tế bào theo thời gian nuôi cấy Kết quả hình 3.7 cho thấy: tế bào thông đỏ phát triển tăng dần theo thời gian và đạt cao nhất ở ngày thứ 14, sau đó khối lượng tế bào giảm dần. Như vậy, thời gian cho 1 chu kì nuôi tế bào thông đỏ trong môi trường lỏng là 14 ngày. Sau 14 ngày nếu muốn duy trì tế bào phải cấy chuyển sang môi trường nuôi cấy mới có đủ chất dinh dưỡng.
3.1.3.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ mẫu cấy ban đầu
Khảo sát lượng mẫu tế bào thông đỏ đưa vào nuôi cấy ban đầu (so với thể tích môi trường) ở các tỷ lệ 10; 15; 20; 25 và 30% (kl/tt). Sau 14 ngày nuôi cấy xác định tỷ lệ tăng trưởng của các mẫu. Kết quả được trình bày trong bảng 3.14.
Bảng 3.14. Ảnh hưởng của tỷ lệ mẫu cấy ban đầu tới tốc độ phát triển của tế bào
STT
Tỷ lệ mẫu
(%)
Số mẫu cấy
Khối lượng tế bào (g) (X ± SD)
Tỷ lệ sinh trưởng
(lần)
p 1 10 10 17, 25 ± 0,57 1,73 ± 0,06 p3-1< 0,05 2 15 10 24,59 ± 0,89 2,48 ± 0,08 p3-2< 0,05 3 20 10 28,29 ± 1,36 2,83 ± 0,07 * 4 25 10 28,78 ± 2,81 2,89 ± 0,09 p3-4>0,05 5 30 10 25,02 ± 2,05 2,60 ± 0,11 p3-5< 0,05
Kết quả bảng 3.14 cho thấy: ở tỷ lệ mẫu cấy 20 – 25% thì tốc độ phát triển của tế bào thông đỏ đạt cao hơn (2,83 - 2,89 lần) so với các nhóm còn lại (với p<0,05). Ở tỷ lệ mẫu cấy 25% tốc độ phát triển của tế thay đổi không đáng kể so với mẫu ở tỷ lệ 20% (với p>0,05), trong khi lượng mẫu sử dụng lại nhiều hơn. Do vậy sử dụng tỷ lệ mẫu cấy 20% là thích hợp cho nuôi cấy tế bào thông đỏ.
3.1.3.4. Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy
Nuôi cấy tế bào thông đỏ (tỷ lệ 20%) trong môi trường SH có bổ sung NAA (2,0 mg/l), BAP (1,0 mg/l), saccharose (20 g/l), điều chỉnh pH môi trường từ 5,2 đến 6,2. Sau 14 ngày nuôi cấy, lọc lấy tế bào, xác định khối lượng tế bào khô và tỷ lệ sinh trưởng. Kết quả được trình bày trong bảng 3.15.
Bảng 3.15. Ảnh hưởng của pH môi trường tới tốc độ phát triển của tế bào thông đỏ
STT pH Số mẫu cấy
Khối lượng tế bào (g) (x±SD)
Tỷ lệ sinh
trưởng (lần) p 1 5,2 10 25,51 ± 1,45 2,55 ± 0,14 p3-1 < 0,05 2 5,4 10 27,19 ± 1,44 2,72 ± 0,15 p3-2 < 0,05 3 5,6 10 28,29 ± 1,36 2,83 ± 0,13 * 4 5,8 10 27,43 ± 0,87 2,74 ± 0,14 p3-4 < 0,05 5 6,0 10 26,02 ± 2,05 2,60 ± 0,12 p3-5 < 0,05 6 6,2 10 24,67 ± 1,52 2,46 ± 0,06 p3-6 < 0,05
Kết quả bảng 3.15 cho thấy: khi nuôi cấy trong các môi trường pH khác nhau thì tốc độ sinh trưởng của tế bào thay đổi. Ở khoảng pH từ 5,4 – 5,8 tốc độ phát triển tốt. Với pH=5,6 tế bào phát triển tốt nhất với tỷ lệ sinh trưởng đạt 2,83 lần (p< 0,05).
3.1.3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy
Sau khi đã chọn được pH môi trường nuôi cấy thích hợp, tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đối với tốc độ phát triển của tế bào.
Kết quả khảo sát được trình bày trong bảng 3.16.
Bảng 3.16. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy tới tốc độ phát triển của tế bào thông đỏ
STT Nhiệt độ (0C)
số mẫu
cấy
Khối lượng tế bào (g) (x±SD)
Tỷ lệ sinh
trưởng (lần) p 1 18 10 19,34 ± 0,92 1,93 ± 0,08 p4-1 < 0,05 2 20 10 22,35 ± 0,83 2,24 ± 0,10 p4-2 < 0,05 3 22 10 26,78 ± 1,22 2,67 ± 0,12 p4-3 < 0,05 4 24 10 28,29 ± 1,36 2,83 ± 0,11 * 5 26 10 27,35 ± 1,09 2,72 ± 0,10 p4-5 < 0,05 6 28 10 25,02 ± 1,27 2,50 ± 0,12 p4-6< 0,05 Kết quả bảng 3.16 cho thấy: ở nhiệt độ 240C tốc độ phát triển của tế bào tốt nhất với tỷ lệ tăng trưởng đạt 2,83 lần (p<0,05). Như vậy nhiệt độ thích hợp cho nuôi cấy tế bào thông đỏ trong môi trường lỏng là 240C.
3.1.3.6. Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng
* Ảnh hưởng của loại chất kích thích sinh trưởng
Sử dụng các chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin (NAA, IBA nồng độ 2,0 mg/l) sử dụng riêng rẽ hoặc kết hợp với các chất nhóm cytokinin (BAP nồng độ 1,0 mg/l và kinetin 0,2 mg/l). Nuôi cấy tế bào trong môi trường lỏng SH. Sau 14 ngày, lọc lấy tế bào cân xác định khối lượng tế bào khô và tỷ lệ tăng trưởng tế bào. Kết quả trình bày ở bảng 3.17.
Bảng 3.17. Ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng đến tốc độ phát triển tế bào
STT Chất kích thích sinh trưởng
số mẫu
cấy
Khối lượng tế bào (g) (x±SD)
Tỷ lệ sinh
trưởng (lần) p 1 NAA 10 21,93 ± 1,05 2,19 ± 0,10 p4-1 < 0,05 2 IBA 10 19,34 ± 0,81 1,92 ± 0,08 p4-2 < 0,05 3 NAA + Ki 10 26,02 ± 2,05 2,60 ± 0,11 p4-3 < 0,05 4 NAA + BAP 10 28,29 ± 1,36 2,83 ± 0,11 * 5 IBA + BAP 10 22,34 ± 0,83 2,23 ± 0,09 p4-5 < 0,05 6 IBA + Ki 10 20,23 ± 1,27 2,02 ± 0,11 p4-6< 0,05
Kết quả bảng 3.17 cho thấy: trong số các chất kích thích sinh trưởng được sử dụng, cặp chất NAA và BAP cho tốc độ phát triển tế bào tốt nhất (đạt 28,29 g và tỷ lệ sinh trưởng đạt 2,83 lần). Sự khác biệt so với các nhóm khác có ý nghĩa thống kê với p < 0,05.
* Ảnh hưởng của nồng độ BAP
Nuôi cấy tế bào thông đỏ trong môi trường lỏng SH, bổ sung NAA (2,0 mg/l), saccharose (20 g/l) và BAP ở các nồng độ khác nhau từ 0,5 mg/l đến 3 mg/l. Sau 14 ngày nuôi cấy, xác định khối lượng tế bào khô và tỷ lệ sinh trưởng. Kết quả được trình bày ở bảng 3.18.
Bảng 3.18. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến đến tốc độ phát triển tế bào
STT
Nồng độ BAP (mg/l)
Số mẫu
cấy
Khối lượng tế bào (g) (x±SD)
Tỷ lệ sinh
trưởng (lần) p 1 0,5 10 20,62 ± 1,41 2,06 ± 0,07 p4-1 < 0,05 2 1,0 10 28,29 ± 1,36 2,82 ± 0,11 p4-2 < 0,05 3 1,5 10 30,20 ± 1,61 3,02 ± 0,10 p4-3 < 0,05 4 2,0 10 33,56 ± 1,60 3,27 ± 0,06 * 5 2,5 10 32,98 ± 1,33 3,28 ± 0,08 p4-5 > 0,05 6 3,0 10 33,24 ± 1,63 3,30 ± 0,09 p4-6> 0,05 7 3,5 10 33,61 ± 1,27 3,34 ± 0,08 p4-6< 0,05
Kết quả của bảng 3.18 cho thấy: khi tăng nồng độ BAP từ 0,5 đến 2,0 mg/l thì tốc độ phát triển của tế bào tăng lên, trong đó tại nồng độ 2,0 mg/l thì tốc độ sinh trưởng của tế bào đạt cao đạt 3,27 lần (p< 0,05). Nếu tiếp tục tăng nồng độ BAP lên 2,5 mg/l và 3,0 mg/l thì tốc độ phát triển tế bào tăng không đáng kể (p>0,05). Như vậy nồng độ BAP thích hợp cho nuôi cấy tế bào thông đỏ trong môi trường lỏng là 2 mg/l.
* Ảnh hưởng của nồng độ NAA
Nuôi cấy tế bào thông đỏ trong môi trường lỏng SH có bổ sung BAP (2,0 mg/l), saccharose (20 g/l), đồng thời thêm NAA ở các nồng độ khác nhau 1,0;
2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0 mg/l. Sau 14 ngày nuôi cấy, thu hoạch tế bào, xác định khối lượng tế bào tươi, khô và tỷ lệ tăng trưởng. Kết quả được trình bày ở bảng 3.19.
Bảng 3.19. Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến tốc độ phát triển tế bào.
STT
Nồng độ NAA (mg/l)
Số mẫu
cấy
Khối lượng tế bào (g)
(x±SD)
Tỷ lệ sinh trưởng
(lần)
p 1 1,0 10 25,35 ± 1,51 2,53 ± 0,07 p3-1 < 0,05 2 2,0 10 33,56 ± 1,60 3,27 ± 0,06 p3-2 < 0,05 3 3,0 10 40,31 ± 1,84 4,01 ± 0,10 * 4 4,0 10 40,68 ± 1,46 4,05 ± 0,08 p3-4> 0,05 5 5,0 10 40,90 ± 1,79 4,07 ± 0,06 p3-5 > 0,05 6 6,0 10 41,11 ± 1,71 4,09 ± 0,09 p3-6> 0,05
Kết quả bảng 3.19 cho thấy: cho thấy khi tăng nồng độ NAA từ 1,0 đến 3,0 mg/l thì tốc độ phát triển của tế bào tăng lên, trong đó tại nồng độ 3,0 mg/l thì tốc độ sinh trưởng của tế bào đạt cao đạt 4,01 lần (p< 0,05). Tuy nhiên, nếu tiếp tục tăng nồng độ NAA từ 3,0 mg/l đến 6,0 mg/l thì tốc độ phát triển tế bào tăng không đáng kể ( p>0,05). Như vậy, nồng độ NAA thích hợp cho nuôi cấy tế bào thông đỏ là 3 mg/l.
3.1.3.7. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ đường
Sau khi lựa chọn được nồng độ chất kích thích sinh trưởng thích hợp, nuôi cấy tế bào trong môi trường SH có bổ sung NAA (3,0 mg/l), BAP (2,0 mg/l) và saccharose theo nồng độ 15, 20, 25, 30, 35 g/l. Sau 14 ngày nuôi cấy kết quả được trình bày trong bảng 3.20.
Bảng 3.20. Ảnh hưởng của nồng độ saccharose tới tốc độ phát triển tế bào.
STT
Nồng độ saccharose
(g/l)
số mẫu
cấy
Khối lượng tế bào (g)
(x±SD)
Tỷ lệ sinh
trưởng (lần) p 1 15 10 30,20 ± 1,61 3,02 ± 0,08 p4-1 < 0,05 2 20 10 40,31 ± 1,84 4,01 ± 0,10 p4-2 < 0,05 3 25 10 44,33 ± 2,22 4,41 ± 0,11 p4-3 < 0,05 4 30 10 51,61 ± 2,16 5,14 ± 0,09 * 5 35 10 46,75 ± 1,29 4,65 ± 0,12 p4-5>0,05
Kết quả bảng 3.20 cho thấy: khi sử dụng saccharose nồng độ 30 g/l tốc độ phát triển tế bào cao nhất với khối lượng tế bào đạt 51,61 g/l và tỷ lệ tăng trưởng đạt 5,14 lần (p<0,05). Như vậy, nồng độ saccharose thích hợp cho nuôi cấy tế bào thông đỏ là 30 g/l.
3.1.3.8. Khảo sát lựa chọn các chất kích thích sinh tổng hợp hoạt chất
* Lựa chọn các chất kích thích sinh tổng hợp hoạt chất (elicitor) - Khảo sát lựa chọn loại elicitor
Nuôi cấy tế bào thông đỏ trong môi trường SH với thành phần đã khảo sát ở trên. Sau 12 ngày, bổ sung các elicitor gồm MJ, JA, acid caffeic, acid ferulic nồng độ 150 àM và dịch chiết nấm men nồng độ 100 àg/g. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của từng elicitor đến tốc độ phát triển tế bào và hàm lượng paclitaxel được trình bày trong bảng 3.21.
Bảng 3.21. Ảnh hưởng của các elicitor tới tốc độ phát triển tế bào và hàm lượng paclitaxel trong tế bào
STT Loại elicitor n Khối lượng tế
bào khô (g) Paclitaxel (mg/l) 1 Mẫu chứng 10 52,41±2,43 6,48±0,17 p3-1< 0,05 2 JA 10 36,83±2,10 8,84±0,21 P3-2< 0,05
3 MJ 10 38,98±1,98 9,39±0,20 *
4 Acid ferulic 10 45,22±2,21 7,53±0,14 p3-4< 0,05 5 Acid caffeic 10 46,39±1,86 7,64±0,18 p3-5< 0,05 6 Elicitor nấm 10 43,83±2,27 7,34±0,16 p3-6< 0,05 7 Acid salicylic 10 44,78±1,53 7,62±0,17 p3-7< 0,05
Kết quả bảng 3.21 cho thấy: khi sử dụng các elicitor trong nuôi cấy tế bào thông đỏ, hàm lượng hoạt chất trong sinh khối tế bào đã cải thiện đáng kể so với nhóm không dùng elicitor. Trong đó, MJ có hiệu quả nhất khi hàm lượng paclitaxel tăng lên 9,39 mg/l so với nhóm không dùng elicitor là 6,48 mg/l (p<0,05). Tuy nhiên, việc sử dụng elicitor dẫn đến làm giảm sự phát triển của tế bào so với nhóm không dùng.
- Khảo sát lựa chọn nồng độ methyl jasmonat
Sau khi đã lựa chọn được MJ sử dụng là chất kích thích tăng hoạt chất.
Khảo sỏt ảnh hưởng của nồng độ MJ từ 50 – 350 àM. Sau 48 giờ cho tiếp xỳc với tế bào, thu hoạch tế bào, xác định khối lượng khô, hàm lượng paclitaxel.
Kết quả thực nghiệm được trình bày trong bảng 3.22.
Bảng 3.22. Ảnh hưởng của nồng độ MJ tới tốc độ phát triển tế bào và hàm lượng paclitaxel trong tế bào
STT
Nồng độ MJ (àM)
số mẫu cấy
Khối lượng tế
bào khô (g) Paclitaxel (mg/l) 1 0 10 48,43±1,87 6,50±0,31 p3-1< 0,05 2 50 10 43,15±1,22 8,97±0,36 p3-2< 0,05
3 100 10 41,45±2,04 10,39±0,37 *
4 150 10 38,98±1,98 9,42±0,39 p3-4< 0,05 5 200 10 36,34±1,54 9,38±0,21 p3-5< 0,05 6 250 10 35,17±1,14 8,73±0,15 p3-6< 0,05 7 300 10 33,22±1,68 6,22±0,12 p3-7< 0,05 8 350 10 29,82±1,75 4,89±0,14 p3-8< 0,05
Kết quả bảng 3.22 cho thấy: trong số các khoảng nồng độ MJ sử dụng thỡ ở nồng độ 100 àM, hàm lượng paclitaxel trong sinh khối tế bào đạt cao nhất đạt 10,39 mg/l (p<0,05), khối lượng tế bào giảm ít nhất (41,45 g/l).
Trong khi ở các nhóm khác hàm lượng paclitaxel tăng không nhiều mà khối lượng tế bào lại giảm. Như vậy, nồng độ MJ thích hợp cho nuôi cấy tế bào thụng đỏ là 100 àM.
* Khảo sát điều kiện sử dụng elicitor
- Khảo sát lựa chọn thời gian tiếp xúc của elicitor
Để khảo sát lựa chọn thời gian tiếp xúc giữa tế bào và elicitor cho phù hợp. Tiến hành nuôi cấy mẫu tế bào thông đỏ trong môi trường SH như trên. Sau 12 ngày nuụi cấy, bổ sung MJ (100 àM) vào mụi trường. Tiếp tục duy trỡ nuụi cấy trong thời gian từ 1 ngày đến 6 ngày. Sau đó thu hoạch, xác định khối lượng tế bào khô, hàm lượng paclitaxel. Kết quả được trình bày trong bảng 3.23.
Bảng 3.23. Ảnh hưởng của thời gian tiếp xúc giữa tế bào và MJ tới tốc độ phát triển tế bào và hàm lượng paclitaxel trong tế bào
STT
Thời gian tiếp xúc với elicitor
(ngày)
Số mẫu
cấy
Khối lượng tế
bào khô (g) Paclitaxel (mg/l) 1 mẫu chứng 10 48,31±2,34 6,49±0,31 p6-1< 0,05 2 1 10 44,37±2,12 7,21±0,26 p6-2< 0,05 3 2 10 44,23±1,97 8,75±0,21 p6-3< 0,05 4 3 10 41,45±2,04 10,39±0,37 p6-4< 0,05 5 4 10 42,98±2,02 11,06±0,28 p6-5< 0,05
6 5 10 42,37±2,17 12,32±0,12 *
7 6 10 39,65±1,98 9,93±0,27 p6-7< 0,05
Kết quả bảng 3.23 cho thấy: thời gian tiếp xúc giữa elicitor và tế bào càng lâu thì hàm lượng hoạt chất càng tăng. Trong đó, tiếp thời gian tiếp xúc 5 ngày thì hàm lượng paclitaxel tăng cao nhất đạt 12,32 mg/l (với p<0,05).
Tuy nhiên, nếu kéo dài thời gian tiếp xúc 6 ngày thì cả khối lượng tế bào và hàm lượng paclitaxel thu được đều giảm. Như vậy thời gian tiếp xúc phù hợp của elicitor với tế bào là 5 ngày.
- Khảo sát lựa chọn thời điểm tiếp xúc của elicitor
Tiến hành nuôi cấy mẫu tế bào thông đỏ trong môi trường SH bổ sung NAA (3,0 mg/l); BAP (2,0 mg/l); saccharose (30g/l); pH = 5,6. Theo dừi tế bào nuụi cấy và thờm MJ (100àM) vào cỏc thời điểm 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 ngày của chu kì nuôi cấy. Sau 5 ngày cho tiếp xúc với elicitor, thu hoạch tế bào, tiến hành xác định khối lượng tế bào khô, hàm lượng paclitaxel. Kết quả trình bày trong bảng 3.24.
Bảng 3.24. Ảnh hưởng của thời điểm tiếp xúc giữa tế bào và MJ tới tốc độ phát triển tế bào và hàm lượng paclitaxel khối tế bào
STT Thời điểm tiếp xúc (ngày thứ)
Số mẫu
cấy
Khối lượng tế
bào khô (g) Paclitaxel (mg/l) 1 4 10 17,43±2,21 4,72±0,09 P5-1< 0,05 2 6 10 17,42±1,38 5,61±0,11 P5-2< 0,05 3 8 10 24,84±2,05 6,06±0,17 P5-3< 0,05 4 10 10 32,55±1,29 9,83±0,22 P5-4< 0,05
5 12 10 42,28±1,57 12,45±0,19 *
6 14 10 42,83±1,43 10,52±0,24 P5-6< 0,05 7 16 10 46,35±2,37 9,92±0,15 P5-7< 0,05
Kết quả bảng 3.24 cho thấy: Khi cho elicitor tiếp xúc với tế bào ở ngày thứ 12 của chu kỳ nuôi cấy, hàm lượng paclitaxel cao nhất đạt 12,45 mg/l (với p<0,05) tăng 1,9 lần so với môi trường đối chứng không sử dụng elicitor.
Trong khi khối lượng tế bào thu được giảm không nhiều so với nhóm chứng.
Như vậy, elicitor tiếp xúc với tế bào thông đỏ ở ngày thứ 12 của chu kỳ nuôi cấy, hàm lượng paclitaxel được cải thiện tốt nhất.
3.1.3.9. Khảo sát phối hợp giữa sử dụng elicitor và bổ sung saccharose
* Kết quả khảo sát thời điểm bổ sung saccharose
Nuôi cấy mẫu tế bào thông đỏ trong môi trường SH bổ sung NAA (3,0 mg/l); BAP (2,0 mg/l); saccharose (30g/l); pH = 5,6. Sau các ngày thứ 2, 6, 10 và 14 của chu kì nuôi cấy, bổ sung thêm saccharose (20 g/l) vào môi trường nuụi cấy ở cỏc ngày thứ. Đồng thời bổ sung MJ (100 àM) vào ngày thứ 12.
Sau 17 ngày nuôi cấy tiến hành thu hoạch tế bào sinh khối. Kết quả xác định khối lượng tế bào khô và hàm lượng paclitaxel được thể hiện trong bảng 3.25.
Bảng 3.25. Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung saccharose STT
Thời điểm bổ sung saccharose (ngày thứ)
Số mẫu
cấy
Khối lượng tế bào khô (g)
Paclitaxel
(mg/l) p
1 Mẫu chứng 10 48,23±2,11 6,51±0,09 p5-1<0,05 2 Không bổ sung
đường
10 42,28±1,57 12,45±0,19 p5-2<0,05
3 2 10 38,25±2,09 9,72±0,29 p5-3<0,05 4 6 10 42,41±1,89 11,26±0,36 p5-4<0,05
5 10 10 42,57±1,54 15,10±0,42 *
6 14 10 44,06±2,08 12,47±0,33 p5-6<0,05 Kết quả bảng 3.25 cho thấy: khi bổ sung saccharose vào môi trường nuôi cấy vào ngày thứ 10 (gần pha ổn định), hàm lượng paclitaxel cao nhất đạt 15,1 mg/l (p<0,05). Trong khi khối lượng tế bào giảm không nhiều so với nhóm không bổ sung saccharose. Như vậy, thêm saccharose vào ngày thứ 10 thì hàm lượng hoạt chất trong sinh khối tế bào cải thiện tốt nhất so với việc thêm vào các ngày khác của chu kỳ nuôi cấy tế bào thông đỏ.
* Kết quả khảo sát nồng độ saccharose bổ sung
Sau khi đã lựa chọn được thời điểm thêm đường, tiến hành khảo sát ảnh hưởng nồng độ saccharose bổ sung khác nhau: 10, 15, 20 và 25 g/l ở ngày thứ 10 (gần pha ổn định). Đến ngày thứ 12 thờm MJ (100 àM). Tiếp tục nuụi cấy
đến ngày thứ 14. Lọc lấy tế bào, sấy khô. Xác định khối lượng tế bào và và định lượng xác định hàm lượng paclitaxel. Kết quả được trình bày trong bảng 3.26.
Bảng 3.26. Ảnh hưởng của nồng độ saccharose bổ sung vào môi trường
STT
Nồng độ đường
(g/l)
số mẫu
cấy
Khối lượng tế
bào khô (g/l) Paclitaxel (mg/l)
1 5 10 41,43 ± 1,07 12,35 ± 0,75 p4-1<0,05 2 10 10 40,59 ±1,21 13,17 ± 0,45 p4-2<0,05 3 15 10 42,21 ± 1,26 14,35 ± 0,41 p4-3<0,05 4 20 10 42,57 ± 1,54 15,12 ± 0,42 * 5 25 10 32,39 ± 1,64 11,51 ± 0,89 P4-5<0,05
Kết quả bảng 3.26 cho thấy: khi bổ sung saccharose (20 g/l) vào ngày thứ 10 của chu kỳ nuôi cấy, hàm lượng paclitaxel trong sinh khối tế bào thông đỏ cao nhất đạt 15,12 mg/l (p<0,05), khối lượng tế bào đạt 42,57 g/l. Trong khi, bổ sung nồng độ 25 g/l thì hàm lượng hoạt chất và khối lượng tế bào đều giảm. Như vậy, việc bổ sung saccharose với nồng độ 2% vào ngày thứ 10 của chu kỳ nuôi cấy tế bào thông đỏ là phù hợp hơn cả với nuôi cấy tế bào thông đỏ.