chất trong nuụi cấy tế bào thực vật
1.2.3.1. Mụi trường nuụi cấy
* Loại mụi trường nuụi cấy
Thành phần mụi trường là một trong hai nhúm yếu tố quyết định thành cụng của quỏ trỡnh tạo sinh khối. Mụi trường nuụi cấy phự hợp sẽ thỳc đẩy tế bào phỏt triển. Đồng thời, mụi trường cũng ảnh hưởng tới cỏc quỏ trỡnh sinh lý, sinh húa của tế bào, làm tăng năng suất và hàm lượng hoạt chất. Cỏc nhà khoa học đó thiết lập được một số mụi trường nuụi cấy cơ bản với những thành phần và tỷ lệ muối vụ cơ khỏc nhau [47]. Mụi trường thường được sử dụng nhất trong nuụi cấy mụ tế bào thực vật là Murashige - Skoog (MS). Bờn cạnh đú cũn cú nhiều loại mụi trường khỏc như B5, Nitsch, White... [46].
* Vai trũ của một số yếu tố trong mụi trường nuụi cấy
- Nguồn hydratcarbon
Hydratcarbon là nguồn cung cấp toàn bộ năng lượng cho tế bào phỏt triển khi nuụi cấy trong điều kiện cỏc tế bào đó bị tỏch li hoàn toàn ra khỏi cõy. Cỏc đường thường được sử dụng là glucose, saccharose, maltose, fructose... , cú thể sử dụng riờng lẻ hay kết hợp trong quỏ trỡnh nuụi cấy [130].
Nồng độ và loại đường khụng những ảnh hưởng đến tốc độ phỏt triển của tế bào mà cũn ảnh hưởng đến sinh tổng hợp cỏc sản phẩm chuyển húa thứ cấp. Vỡ khi nồng độ đường trong mụi trường nuụi cấy làm tăng ỏp lực thẩm thấu và tỏc động vào tế bào thỡ nú kớch thớch làm tăng tổng hợp cỏc phytoalexin [11], [102]. Kết quả nghiờn cứu nuụi cấy tế bào Coleus blumei Benth. cho thấy khi dựng saccharose 7,5% trong mụi trường nuụi cấy, thỡ hàm lượng hoạt chất là 3,3 g/l, nếu dựng saccharose 2,5% thỡ hàm lượng hoạt chất chỉ đạt 0,8% [94]. Vỡ vậy, trong thực nghiệm, phải tối ưu húa loại và nồng độ đường nhằm đảm bảo cho tế bào phỏt triển tốt nhất, hàm lượng hoạt chất cao nhất.
- Hormon thực vật
Hormon thực vật hoặc cỏc chất kớch thớch sinh trưởng rất cần thiết đối với cỏc tế bào chưa biệt hoỏ để đẩy mạnh sự tăng trưởng của nhiều dũng tế bào. Hormon thực vật thường dựng trong sinh khối gồm 2 nhúm chớnh:
+ Nhúm khung auxin: gồm 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), 1- naphtalenacetic acid (NAA), indole-3-acetic acid (IAA) và indole-3-butyric acid (IBA) thường xuyờn được sử dụng với nồng độ trong khoảng 0,1 – 50 àM dựng làm chất kớch thớch tăng trưởng trong nuụi cấy tế bào. Đặc biệt, trong sinh khối tế bào, NAA và 2,4-D là những chất khụng thể thiếu nhất là ở giai đoạn nuụi cấy tạo callus [11], [44], [64].
+ Nhúm cytokinin: gồm kinetin và benzyladenin cú vai trũ làm tăng sinh tổng hợp nguyờn liệu di truyền, kớch thớch quỏ trỡnh sinh trưởng làm cho tế bào phỏt triển nhanh hơn. Cỏc chất này thường được sử dụng kết hợp với nhúm auxin như 2,4-D, NAA. Mỗi loại tế bào thực vật khỏc nhau yờu cầu
nồng độ hormon thực vật khỏc nhau cho sự phỏt triển của tế bào cũng như tạo cỏc sản phẩm thứ cấp của nú. Việc lựa chọn cỏc chất kớch thớch sinh trưởng thớch hợp nhất đối với mỗi loại thực vật là một khõu trong quỏ trỡnh nghiờn cứu tạo sinh khối [44], [119].
Ngoài 2 nhúm trờn, cỏc chất khỏc: acid gilberilic và cỏc ethylen... cũng cú thể được sử dụng để kớch thớch tăng tổng hợp hoạt chất [67].
- Cỏc biện phỏp kớch thớch làm tăng hàm lượng hoạt chất
Cỏc kỹ thuật phổ biến để tăng tớch lũy hoạt chất là: dựng cỏc chất kớch thớch sinh tổng hợp hoạt chất (elicitor) hoặc cỏc tiền chất cho quỏ trỡnh sinh tổng hợp hoạt chất, kỹ thuật nuụi cấy 2 pha, nghiệm phỏp gen kớch hoạt, bất động tế bào, nuụi cấy 2 giai đoạn... Trong đú, cỏc elicitor chất làm tăng hàm lượng hoạt chất thường được sử dụng. Elicitor là cỏc chất cú bản chất hoỏ học khỏc nhau từ nhiều nguồn gốc, cú tỏc dụng kớch thớch tạo cỏc sản phẩm chuyển hoỏ thứ cấp để chống đỡ lại cỏc mầm bệnh khi xõm nhập vào tế bào thực vật, trong đú cú việc kớch thớch làm tăng sinh tổng hợp cỏc hoạt chất. Bỡnh thường, hệ thống tự bảo vệ trong tế bào được khởi động khi cú tỏc nhõn cú hại tỏc động vào tế bào [22], [65].
Những chất cú khả năng kớch thớch khởi động hệ thống tự bảo vệ này gọi là cỏc elicitor. Elicitor liờn kết với receptor trờn màng tế bào. Cỏc tớn hiệu của elicitor được truyền đi thụng qua cỏc chất truyền tớn hiệu thứ cấp (kờnh ion, GTP, phõn tử oxy hoạt động, inositol 1,4,5 - trisphosphate, cỏc enzym, cỏc chất trung gian dẫn truyền ...) dẫn đến kết quả cuối cựng kớch thớch sinh tổng hợp cỏc sản phẩm chuyển hoỏ thứ cấp, nhằm bảo vệ tế bào, trong đú cú cỏc hoạt chất sinh học [65]. Elicitor được chia làm 2 loại:
+ Elicitor hữu sinh (biotic elicitor): gồm cỏc chất (nội sinh hay ngoại sinh) cú nguồn gốc từ cỏc cơ thể sống: thực vật, vi sinh vật, nấm... Elicitor ngoại sinh (exogenous elicitor) là những thành phần đó cú hoạt tớnh kớch thớch tổng hợp hoạt chất. Elicitor nội sinh (endogenous elicitor) là sản phẩm tương
tỏc của chớnh cỏc yếu tố gõy bệnh với tế bào thực vật sinh ra. Đõy là cỏc chất kớch thớch sinh tổng hợp hoạt chất thực sự [102].
+ Elicitor vụ sinh (abiotic elicitor): là cỏc chất cỏc yếu tố khụng cú nguồn gốc từ cơ thể sống gồm cỏc chất hoỏ học tổng hợp (acid salicylic, acid benzoic, acid ferulic, acid jasmonic...), cỏc yếu tố vật lý (ỏnh sỏng, tia tử ngoại, nhiệt độ ...), ion kim loại nặng và những tổn thương cơ học... [102].
Khi tiến hành nghiờn cứu sử dụng cỏc elicitor, cần phải lựa chọn được loại và nồng độ elicitor cũng như thời gian tiếp xỳc của từng loại elicitor thớch hợp cho từng loại tế bào.
- Cỏc nguyờn tố đa lượng
Bao gồm cỏc loại muối của nitơ, phospho, kali, calci, magnesi và sulfua. Đõy là cỏc nguyờn tố chớnh cần thiết cho sinh trưởng của thực vật bậc cao. Nếu cõy trồng tự nhiờn cần cỏc muối vụ cơ để sinh trưởng và phỏt triển, thỡ để nuụi cấy thành cụng những tế bào chưa biệt húa, đũi hỏi phải cung cấp đầy đủ nguồn nitơ và cỏc ion vụ cơ như phospho, kali, calci, magne, mangan và sulfua. Trong đú, nguồn nitơ thường chiếm tỷ lệ cao [85]. Nguồn nitơ được đưa vào dưới dạng cỏc muối amoni hoặc nitrat như NH4NO3, NaNO3 hoặc kết hợp với cỏc muối khỏc như NH4H2PO4 và Ca(NO3)2. Tuy nhiờn, việc cõn đối giữa tỷ lệ NH4+ /NO3- rất quan trọng, vỡ nú ảnh hưởng tới hàm lượng hoạt chất cú trong sinh khối tế bào [11]. Theo S. Lui và cs [86] trong sinh khối tế bào sõm Hoa Kỳ (Panax notoginseng Wall.) hàm lượng saponin tăng khi tỷ lệ NH4+/NO3- giảm. Nhưng nếu tăng lượng amoni quỏ cao cú thể gõy độc cho tế bào và hàm lượng saponin lại giảm.
- Cỏc nguyờn tố vi lượng
Bao gồm cỏc loại muối của sắt, kẽm, mangan, đồng, molybden và coban ở dạng vi lượng. Cỏc vi khoỏng chất là những thành phần khụng thể thiếu đối với tế bào thực vật. Cỏc chất này đúng vai trũ như là cỏc coenzym tham gia vào cỏc quỏ trỡnh sinh lý, sinh húa của tế bào. Đặc biệt, chỳng tham gia vào kớch hoạt cỏc enzym của quỏ trỡnh sinh tổng hợp cỏc hoạt chất [86], [99].
- Cỏc phụ gia hữu cơ
Một lượng nhỏ cỏc loại vitamin (myoinositol, thiamin, acid nicotinic, pyridoxine, riboflavin...) đúng vai trũ là cỏc coenzym tham gia cỏc quỏ trỡnh chuyển húa của tế bào nờn cú tỏc dụng kớch thớch sự phỏt triển của tế bào. Cỏc acid amin (thường cho phộp bỏ qua nhưng trong một số trường hợp đặc biệt thỡ cú thể dựng) và cỏc phụ gia hữu cơ khỏc (dịch chiết nấm men, dịch thủy phõn casein, nước dừa, một số dịch chiết từ thực vật...) cũng chứa cỏc yếu tố tăng trưởng gúp phần kớch thớch tế bào phỏt triển. Vỡ vậy, chỳng được thờm vào mụi trường nuụi cấy, gúp phần làm tế bào phỏt triển tốt hơn [65].
1.2.3.2. Ảnh hưởng của cỏc điều kiện nuụi cấy
* Thời gian nuụi cấy
Thời gian nuụi cấy ảnh hưởng lớn tới tốc độ phỏt triển của tế bào và sinh tổng hợp cỏc chất chuyển hoỏ thứ cấp. Tốc độ phỏt triển của cỏc tế bào sinh vật núi chung và tế bào thực vật trong cụng nghệ sinh khối núi riờng đều theo một đường cong phỏt triển. Đường cong này gồm cú 4 pha (hỡnh 1.4) [18].
Hỡnh 1.4. Sự phỏt triển của tế bào thực vật theo thời gian
* Nguồn: theo Alan H.S. (1992) [18]
- Pha tiềm tàng hay cũn gọi là pha thớch nghi (lag phase): tại pha này, cỏc tế bào thực vật gần như khụng phỏt triển, nú đang thớch nghi với điều kiện và mụi trường nuụi cấy mới.
Pha thớch ghi Pha phỏt triển Pha dừng Pha ly giải
Thời gian (ngày)
Khối lượng tế bào (g)
- Pha phỏt triển (exponent phase): ở pha này cỏc tế bào đó trải qua thời gian thớch nghi và bắt đầu phỏt triển với tốc độ theo hàm lũy thừa, khối tế bào phỏt triển nhanh tạo ra một lượng lớn. Trong giai đoạn này nếu cung cấp đầy đủ chất dinh dưỡng, tế bào cú thể phỏt triển tối đa.
- Pha dừng (stationary phase): cỏc tế bào gần như khụng phỏt triển và nhõn lờn nữa. Lượng tế bào trong mụi trường tiến dần tới hằng định. Trong pha này, cỏc tế bào thực vật bắt đầu tổng hợp cỏc chất chuyển hoỏ thứ cấp. Pha này càng dài, lượng hoạt chất trong khối tế bào càng cao. Vỡ vậy, cần phải cung cấp đầy đủ chất dinh dưỡng để duy trỡ sự tồn tại của tế bào, nhằm kộo dài thời gian sinh tớch lũy cỏc sản phẩm thứ cấp [119], [125].
- Pha ly giải hay pha suy tàn (death phase, lysis phase): trong pha này cỏc tế bào thực vật bắt đầu chết dần, lượng tế bào giảm. Biểu hiện bờn ngoài là thay đổi màu sắc tế bào và mụi trường nuụi cấy, pH mụi trường thay đổi. Như vậy, cần phải xỏc định điểm kết thỳc của quỏ trỡnh nuụi cấy, đú là thời điểm trước khi chuyển sang pha ly giải. Khi đú sẽ thu được khối lượng tế bào lớn nhất, hàm lượng hoạt chất cao nhất và khụng bị lóng phớ mụi trường [9].
* Nhiệt độ nuụi cấy
Nhiệt độ nuụi cấy cú ảnh hưởng quan trọng tới sự phỏt triển khối tế bào thực vật và sự hỡnh thành cỏc chất chuyển hoỏ thứ cấp. Mỗi loại tế bào thực vật cú một khoảng nhiệt độ thớch nghi nhất định. Nhiệt độ quỏ thấp sẽ làm tế bào ngừng phỏt triển hoặc chết đi, nhiệt độ quỏ cao sẽ gõy chết tế bào. Trong khoảng nhiệt độ tồn tại của tế bào thực vật, thường cú một nhiệt độ tối ưu. Tại nhiệt độ này, sự phỏt triển của khối tế bào đạt tốc độ tối đa. Tuy nhiờn, khỏc với vi khuẩn và vi nấm, tế bào thực vật thường thớch nghi ở khoảng nhiệt độ thấp từ 20 - 280C [7], [69].
* pH mụi trường nuụi cấy
Ảnh hưởng của pH đến sự phỏt triển của tế bào và sinh tổng hợp của hoạt chất sinh học vẫn chưa được nghiờn cứu đầy đủ. Tuy nhiờn, mụ thực vật cú khả năng thớch nghi lớn với sự thay đổi của pH. Trong mụi trường nuụi
cấy, pH cú thể được điều chỉnh bằng chớnh cỏc tế bào thực vật để tối ưu hoỏ mụi trường nuụi cấy. pH cú ảnh hưởng tới sự phỏt triển của tế bào và sự tổng hợp cỏc chất chuyển hoỏ thứ cấp [32], [55].
* Nồng độ oxy hoà tan
Nhỡn chung, sự phỏt triển của tất cả cỏc tế bào hiếu khớ đều cần sự cú mặt của oxy. Oxy cần thiết cho quỏ trỡnh hụ hấp của tế bào, phõn cắt cỏc phõn tử hữu cơ tạo năng lượng cho cỏc quỏ trỡnh phỏt triển của cơ thể sinh vật. Tốc độ phỏt triển của tế bào thực vật càng cao càng cần nhiều oxy. Trong thực tế, cỏc tế bào thực vật phỏt triển tương đối chậm, chớnh vỡ vậy nồng độ oxy cung cấp cho tế bào khụng cần cao [37], [119].
1.3. SINH KHỐI TẾ BÀO THễNG ĐỎ SẢN XUẤT PACLITAXEL 1.3.1. Nhu cầu nguồn nguyờn liệu paclitaxel trong điều trị ung thư
Paclitaxel là một trong những loại thuốc chống ung thư thành cụng nhất được phỏt triển trong 50 năm qua. Bỡnh quõn mỗi năm doanh số bỏn hàng trờn toàn thế giới của paclitaxel trờn 1,5 tỷ USD - số liệu năm 1999 của Bristol Myers Squibb (cụng ty độc quyền nhón hiệu Taxol). Tuy nhiờn nếu như paclitaxel chỉ được chiết xuất từ cỏc loài thụng đỏ thỡ khụng thể đỏp ứng được nhu cầu điều trị ung thư cho nhõn loại bởi: thụng đỏ là loại cõy cú tốc độ sinh trưởng chậm, mỗi năm bỡnh quõn cõy phỏt triển thờm từ 2-3 cm đường kớnh, khụng những thế hàm lượng hoạt chất trong cõy rất thấp (0,001-0,05%). Để được 1 kg hoạt chất cần 10.000 kg vỏ cõy hoặc 3000 cõy thụng đỏ [125] và điều trị một bệnh nhõn ung thư khỏi bệnh cần chặt hạ khoảng tỏm cõy thụng đỏ 60 tuổi. Ngoài ra, chiết xuất paclitaxel cũng đũi hỏi một hệ thống thiết bị phức tạp và kỹ thuật tinh chế đặc hiệu sử dụng cụng nghệ tiờn tiến và đắt tiền. Trong khi việc tổng hợp toàn phần paclitaxel và cỏc chất dẫn chất chỉ mang giỏ trị khoa học mà khụng cú giỏ trị ứng dụng thực tiễn do cỏc hợp chất này cú cấu trỳc hoỏ học phức tạp gồm nhiều loại đồng phõn như hỡnh học, quang học [61]. Cho tới nay mới chỉ nghiờn cứu việc bỏn tổng hợp paclitaxel và docetaxel từ cỏc chất trung gian như baccatin III hoặc 10-deacetylbaccatin III
chiết xuất trong lỏ của cỏc loài Taxus. Với những khú khăn trờn, việc tạo ra được nguồn paclitaxel và cỏc dẫn chất tương tự thay thế cú tớnh ổn định, bền vững và thõn thiện với mụi trường là rất cần thiết. Cụng nghệ sinh khối tế bào thực vật là phương phỏp cú nhiều lợi thế bởi: cụng nghệ khụng phải chịu ảnh hưởng của thời tiết, mựa hoặc lõy nhiễm, thời gian tạo nguồn ngắn, hàm lượng hoạt chất cú thể được cải thiện so với nuụi trồng tự nhiờn [130]. Đõy là cụng nghệ đang được ứng dụng phổ biến trong sản xuất paclitaxel và cỏc dẫn chất từ tế bào cỏc loài thụng đỏ (Taxus sp.).
1.3.2. Sản xuất paclitaxel bằng cụng nghệ sinh khối tế bào thực vật
Hiện nay cụng nghệ sinh khối tế bào thực vật đó ỏp dụng trong nghiờn cứu và sản xuất paclitaxel từ cỏc loài thụng đỏ. Trong nhiều thập kỉ qua, cỏc nghiờn cứu về sinh tổng hợp paclitaxel và cỏc dẫn chất bằng việc nuụi cấy tế bào cỏc loài thụng đỏ đó được tiến hành như T. brevifolia, T. baccata, T. cuspidata, T. chinensis, T. canadensis, T. yunnanensis, T. x media. Trong đú điển hỡnh là cỏc nghiờn cứu về con đường sinh tổng hợp hoạt chất cũng như cỏc biện phỏp nhằm cải thiện hàm lượng paclitaxel trong sinh khối như: tối ưu húa điều kiện nuụi cấy, sàng lọc cỏc dũng tế bào cú khả năng sinh hoạt chất cao, tối ưu húa mụi trường nuụi cấy, cỏc biện phỏp kớch thớch tăng sinh tổng hợp hoạt chất như sử dụng cỏc chất kớch thớch sinh hoạt chất và cỏc tiền chất, cũng như kỹ thuật nuụi hai pha, nuụi cấy hai giai đoạn và kỹ thuật bất động tế bào [119], [125].
1.3.2.1. Con đường sinh tổng hợp paclitaxel
Paclitaxel được hỡnh thành chủ yếu từ nguyờn liệu ban đầu là cỏc phõn tử geranylgeranyl diphosphat (GGPP) gồm nhiều giai đoạn [125] (hỡnh 1.5).
Việc nghiờn cứu tỡm ra con đường sinh tổng hợp paclitaxel trong thụng đỏ, gúp phần cung cấp cỏc hiểu biết về phản ứng cũng như cỏc enzyme tham gia phản ứng. Từ đú giỳp cỏc nhà khoa học nghiờn cứu cỏc biện phỏp kớch
hoạt làm tăng sinh tổng hợp paclitaxel như: sử dụng tiền chất phenylalanine, sử dụng elicitor, cỏc chất kớch hoạt enzym [41], [125].
Hỡnh 1.5. Con đường sinh tổng hợp của Paclitaxel
1.3.2.2. Lựa chọn cỏc dũng tế bào cú khả năng sinh hoạt chất cao
Dũng tế bào là yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới quỏ trỡnh sinh trưởng cũng như sinh tổng hợp cỏc chất chuyển húa thứ cấp. Đặc biệt, khi nuụi cấy trong mụi trường lỏng, cỏc tế bào cú sự thay đổi đỏng kể về hàm lượng hoạt chất khi nuụi cấy cỏc dũng tế bào khỏc nhau. Điều này là do cú sự khỏc biệt về gen dẫn đến sự khỏc biệt trong hoạt động sinh tổng hợp hoạt chất. Vỡ vậy, trong quỏ trỡnh nghiờn cứu phải tạo ra được những dũng tế bào phỏt triển