1.2.1. Khỏi niệm, ưu điểm và khú khăn khi triển khai
1.2.1.1. Một số khỏi niệm cơ bản
Sinh khối tế bào thực vật là kỹ thuật nuụi cấy và tạo khối lượng lớn tế bào thực vật trong mụi trường dinh dưỡng phự hợp và điều kiện nuụi cấy vụ khuẩn mà khụng cần thõm canh gieo trồng. Cỏc tế bào khi nuụi cấy vẫn giữ nguyờn được cỏc đặc tớnh vốn cú ban đầu, đặc biệt là cỏc hoạt chất hay cỏc chất chuyển húa thứ cấp sinh ra từ cỏc tế bào gần như được giữ nguyờn [9], [73], [111].
Nguyờn tắc của cụng nghệ sinh khối dựa trờn cơ sở tớnh toàn năng (totipotent) và tớnh biệt húa của một số tế bào thực vật. Khi được đưa vào mụi trường dinh dưỡng và điều kiện thớch hợp, cỏc tế bào thực vật cú thể phỏt triển thành một cơ quan, một cõy hoàn chỉnh hoặc một khối lượng lớn dũng tế bào đú. Dựa trờn cơ sở đú, cụng nghệ nuụi cấy mụ thực vật cú thể tạo ra cõy từ đỉnh sinh trưởng được tỏch ra. Sau đú, cõy được nhõn nhanh tạo ra nhiều mầm cõy con, từ đú cú thể kớch thớch tạo rễ và phỏt triển thành cõy hoàn chỉnh. Người ta nuụi cấy tạo mụ sẹo (callus) từ một mụ bất kỡ của cõy. Sau đú, biệt húa thành mụ sinh trưởng, tạo mầm, tạo rễ và cuối cựng cũng phỏt triển thành một cõy mới hoàn chỉnh [57], [112].
Khỏc với nuụi cấy mụ, cụng nghệ sinh khối tế bào thực vật khụng nuụi cấy tạo ra cõy hoàn chỉnh mà chỉ nuụi cỏc tế bào để tạo ra sinh khối và cú thể sử dụng cho chiết tỏch cỏc hoạt chất sinh học. Quỏ trỡnh này cũng bắt đầu từ
việc tạo ra callus từ những mụ khỏc nhau của thực vật. Sau đú, chỳng được làm mất tớnh biệt húa và được thuần húa trong mụi trường dinh dưỡng thớch hợp. Cuối cựng là tăng khối lượng trờn hệ thống bỡnh nuụi cấy (bioreactor). Trong quỏ trỡnh tạo sinh khối tế bào thực vật, đặc tớnh của tế bào được giữ nguyờn như ban đầu. Cỏc quỏ trỡnh sinh học của tế bào vẫn xảy ra như đối với tế bào khi cũn tồn tại trong cõy tự nhiờn, trong đú cú việc tổng hợp và tớch lũy hoạt chất [53], [59].
1.2.1.2. Ưu điểm của cụng nghệ sinh khối tế bào thực vật
Cụng nghệ sinh khối tế bào thực vật khụng chịu tỏc động của cỏc yếu tố tự nhiờn như địa lý, khớ hậu, thổ nhưỡng, bệnh dịch, thiờn tai... do toàn bộ quy trỡnh tạo sinh khối được tiến hành trong phũng thớ nghiệm hoặc nhà mỏy. Điều này giỳp khắc phục được ảnh hưởng bất lợi của điều kiện tự nhiờn tới năng suất, chất lượng sản phẩm và loại bỏ được yếu tố thời vụ như khi gieo trồng nờn giỳp chủ động được nguồn nguyờn liệu phục vụ sản xuất [9], [19].
Thời gian sản xuất nguyờn liệu theo cụng nghệ sinh khối tế bào rỳt ngắn hơn nhiều so với gieo trồng tự nhiờn. Giai đoạn nghiờn cứu từ khi tiến hành tạo callus (giai đoạn đầu tiờn của quy trỡnh) đến việc nuụi cấy trong mụi trường lỏng phải mất khỏ nhiều thời gian. Tuy nhiờn, sau khi đó lựa chọn được điều kiện, mụi trường nuụi cấy thỡ thời gian cho sản xuất một mẻ sinh khối thường khoảng từ 15 - 50 ngày. Như vậy, thời gian đó rỳt ngắn rất nhiều so với trồng cõy ngoài tự nhiờn nờn chủ động được nguồn nguyờn liệu phục vụ sản xuất [9]. Theo Guilk và cs (2006) trong nghiờn cứu xõy dựng quy trỡnh tạo sinh khối dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G.Don.) sản xuất alcaloid nhõn indole, thời gian cho 1 mẻ nuụi cấy sản phẩm là 20 ngày [56]. Trong khi sản xuất sinh khối thụng đỏ Chõu Âu (Taxus baccata) cần thời gian thớch hợp cho 1 chu kỳ nuụi cấy trong mụi trường lỏng là 28 ngày [107].
Chất lượng của sản phẩm sản xuất theo cụng nghệ sinh khối tế bào thực vật rất ổn định. Vỡ cỏc yếu tố nhiệt độ, pH, nồng độ oxy hũa tan, thành phần mụi trường, cường độ ỏnh sỏng... đều được kiểm soỏt chặt chẽ đảm bảo cho tế
bào phỏt triển tốt, hàm lượng hoạt chất ổn định. Do đú, sản phẩm thu được cú chất lượng ổn định đỏp ứng được yờu cầu sản xuất theo tiờu chuẩn GMP [7], [57], [59].
Trong quỏ trỡnh tạo sinh khối tế bào thực vật, cú thể điều khiển quỏ trỡnh sinh tổng hợp để cỏc hoạt chất cú hàm lượng cao hơn so với nuụi trồng ngoài tự nhiờn, nờn kỹ thuật này phự hợp với cỏc dược liệu cú hàm lượng hoạt chất thấp hoặc cỏc chất rất khú tổng hợp húa học được như: taxol, vinblastin, vincristin, shikonin, reserpin... Nghiờn cứu về sinh khối tế bào thụng đỏ cho thấy khi sử dụng cỏc biện phỏp kớch thớch làm tăng hoạt chất thỡ hàm lượng hoạt chất cao hơn trong cõy tự nhiờn từ 10 - 15 lần [148]. Khosroushahi [72] khi nuụi cấy tế bào thụng đỏ đó tối ưu điều kiện và mụi trường nuụi cấy. Kết quả hàm lượng paclitaxel đó cải thiện rất nhiều so với ban đầu.
Đối với cỏc dược liệu quớ hiếm sản xuất theo cụng nghệ này thỡ giỏ thành sản xuất sẽ thấp hơn. Vỡ trong thời gian ngắn cú thể tạo ra một khối lượng lớn sản phẩm trong khi chi phớ cho nuụi cấy thấp [111], [132].
1.2.1.3. Những khú khăn khi triển khai cụng nghệ sinh khối tế bào thực vật
Cú nhiều yếu tố ảnh hưởng đến quỏ trỡnh nuụi cấy tế bào, đú là thành phần mụi trường và điều kiện nuụi cấy (nhiệt độ, ỏnh sỏng, nồng độ oxy hũa tan, pH mụi trường và đặc điểm cấu tạo của hệ thống bỡnh nuụi cấy). Chi phớ đầu tư dõy truyền sản xuất tốn kộm do đặc thự của nuụi cấy tế bào thực vật khỏc với nuụi cấy nấm và vi khuẩn nờn hệ thống cỏc bỡnh nuụi cấy (bioreactor) cần phải thiết kế riờng cho phự hợp với từng loại tế bào [109], [119]. Hàm lượng cỏc hoạt chất trong sinh khối tế bào cũn thấp, đặc biệt là với cỏc tế bào cú nhiều nhúm hoạt chất cựng tồn tại thỡ việc kớch thớch tăng riờng rẽ hàm lượng từng nhúm chất rất khú khăn [9]. Những khú khăn trờn đang được cỏc nhà khoa học tập trung nghiờn cứu khắc phục.
1.2.2. Quy trỡnh tạo sinh khối tế bào thực vật
Quy trỡnh tạo sinh khối tế bào thực vật thường được tiến hành theo năm giai đoạn kế tiếp nhau [9] (hỡnh 1.3).
* Giai đoạn 1: Tạo callus
Callus là dũng tế bào ban đầu, chưa biệt húa được tạo ra trong phũng thớ nghiệm, tương tự như những tế bào gốc tạo ra để hàn gắn vị trớ tổn thương của cõy. Callus được hỡnh thành từ cỏc mụ, cỏc tế bào được tỏch ra từ cơ thể thực vật nhờ tỏc động của chất kớch thớch sinh trưởng. Trong giai đoạn này, ngoài thành phần mụi trường và điều kiện nuụi cấy thỡ kỹ thuật vụ khuẩn được xem là yếu tố quan trọng nhất [9].
* Giai đoạn 2: Duy trỡ nuụi cấy callus trong mụi trường thạch mềm
Việc duy trỡ nuụi cấy trong mụi trường thạch mềm đảm bảo cho tế bào thớch nghi hoàn toàn với điều kiện sống mới (tỏch ly hoàn toàn ra khỏi cơ thể mẹ). Đồng thời, nú làm cho tế bào cú hỡnh thỏi mềm, xốp, cú đủ sức sống và đặc biệt làm mất khả năng biệt hoỏ thành cỏc cơ quan bộ phận khỏc. Điều này tạo thuận lợi cho cấy chuyển tế bào sang mụi trường nuụi cấy lỏng.
Hỡnh 1.3. Quy trỡnh tạo sinh khối tế bào thực vật
a - Tạo callus; b - Duy trỡ nuụi cấy callus; c - Nuụi cấy trong mụi trường lỏng; d - Khuếch đại qui mụ nuụi cấy; e - Thu hoạch sinh khối.
* Nguồn: Nguyễn Văn Long [7]
* Giai đoạn 3: Nuụi cấy tế bào trong mụi trường lỏng
Đõy là bước rất quan trọng, quyết định tốc độ phỏt triển cũng như hàm lượng hoạt chất của sinh khối. Trong giai đoạn này, phải khảo sỏt đầy đủ cỏc
a
b
c
d
yếu tố ảnh hưởng như: điều kiện nuụi cấy, thành phần mụi trường, nhằm mục đớch cho sinh khối phỏt triển nhanh nhất, hàm lượng hoạt chất trong sinh khối cao nhất [7], [116].
* Giai đoạn 4: Nõng cấp quy mụ nuụi cấy (scale-up)
Sau khi đó tỡm được cỏc điều kiện và mụi trường nuụi cấy thớch hợp, để tăng khối lượng sản phẩm, cỏc tế bào phải được nuụi cấy trong hệ thống cỏc bỡnh nuụi cấy cú thể tớch khỏc nhau tựy theo quy mụ. Ở giai đoạn này, cỏc yếu tố về điều kiện sản xuất như loại bỡnh nuụi cấy, kiểu cỏnh khuấy, phõn ỏp oxy hũa tan là những yếu tố cần phải khảo sỏt. Trong quy trỡnh sản xuất taxol và shikonin, người ta đó sử dụng cỏc bioreactor 10.000 và 75.000 lớt [119], [125].
* Giai đoạn 5: Thu hoạch khối tế bào
Thu hoạch khối tế bào là bước cuối cựng trong quy trỡnh nuụi cấy. Thụng thường, cỏc hoạt chất được tớch lũy chủ yếu trong tế bào nờn phương phỏp lọc lấy tế bào là cỏch phổ biến để thu sản phẩm. Tuy nhiờn, cú một số trường hợp hoạt chất lại được giải phúng ra ngoài mụi trường nờn việc thu hồi cỏc hoạt chất mất nhiều cụng sức và chi phớ tốn kộm [111]. Cỏc hoạt chất sau khi tỏch chiết sẽ được nghiờn cứu tỏc dụng sinh học và bào chế sản phẩm.
1.2.3. Cỏc yếu tố ảnh hưởng tới sự phỏt triển tế bào và hàm lượng hoạt chất trong nuụi cấy tế bào thực vật chất trong nuụi cấy tế bào thực vật
1.2.3.1. Mụi trường nuụi cấy
* Loại mụi trường nuụi cấy
Thành phần mụi trường là một trong hai nhúm yếu tố quyết định thành cụng của quỏ trỡnh tạo sinh khối. Mụi trường nuụi cấy phự hợp sẽ thỳc đẩy tế bào phỏt triển. Đồng thời, mụi trường cũng ảnh hưởng tới cỏc quỏ trỡnh sinh lý, sinh húa của tế bào, làm tăng năng suất và hàm lượng hoạt chất. Cỏc nhà khoa học đó thiết lập được một số mụi trường nuụi cấy cơ bản với những thành phần và tỷ lệ muối vụ cơ khỏc nhau [47]. Mụi trường thường được sử dụng nhất trong nuụi cấy mụ tế bào thực vật là Murashige - Skoog (MS). Bờn cạnh đú cũn cú nhiều loại mụi trường khỏc như B5, Nitsch, White... [46].
* Vai trũ của một số yếu tố trong mụi trường nuụi cấy
- Nguồn hydratcarbon
Hydratcarbon là nguồn cung cấp toàn bộ năng lượng cho tế bào phỏt triển khi nuụi cấy trong điều kiện cỏc tế bào đó bị tỏch li hoàn toàn ra khỏi cõy. Cỏc đường thường được sử dụng là glucose, saccharose, maltose, fructose... , cú thể sử dụng riờng lẻ hay kết hợp trong quỏ trỡnh nuụi cấy [130].
Nồng độ và loại đường khụng những ảnh hưởng đến tốc độ phỏt triển của tế bào mà cũn ảnh hưởng đến sinh tổng hợp cỏc sản phẩm chuyển húa thứ cấp. Vỡ khi nồng độ đường trong mụi trường nuụi cấy làm tăng ỏp lực thẩm thấu và tỏc động vào tế bào thỡ nú kớch thớch làm tăng tổng hợp cỏc phytoalexin [11], [102]. Kết quả nghiờn cứu nuụi cấy tế bào Coleus blumei Benth. cho thấy khi dựng saccharose 7,5% trong mụi trường nuụi cấy, thỡ hàm lượng hoạt chất là 3,3 g/l, nếu dựng saccharose 2,5% thỡ hàm lượng hoạt chất chỉ đạt 0,8% [94]. Vỡ vậy, trong thực nghiệm, phải tối ưu húa loại và nồng độ đường nhằm đảm bảo cho tế bào phỏt triển tốt nhất, hàm lượng hoạt chất cao nhất.
- Hormon thực vật
Hormon thực vật hoặc cỏc chất kớch thớch sinh trưởng rất cần thiết đối với cỏc tế bào chưa biệt hoỏ để đẩy mạnh sự tăng trưởng của nhiều dũng tế bào. Hormon thực vật thường dựng trong sinh khối gồm 2 nhúm chớnh:
+ Nhúm khung auxin: gồm 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), 1- naphtalenacetic acid (NAA), indole-3-acetic acid (IAA) và indole-3-butyric acid (IBA) thường xuyờn được sử dụng với nồng độ trong khoảng 0,1 – 50 àM dựng làm chất kớch thớch tăng trưởng trong nuụi cấy tế bào. Đặc biệt, trong sinh khối tế bào, NAA và 2,4-D là những chất khụng thể thiếu nhất là ở giai đoạn nuụi cấy tạo callus [11], [44], [64].
+ Nhúm cytokinin: gồm kinetin và benzyladenin cú vai trũ làm tăng sinh tổng hợp nguyờn liệu di truyền, kớch thớch quỏ trỡnh sinh trưởng làm cho tế bào phỏt triển nhanh hơn. Cỏc chất này thường được sử dụng kết hợp với nhúm auxin như 2,4-D, NAA. Mỗi loại tế bào thực vật khỏc nhau yờu cầu
nồng độ hormon thực vật khỏc nhau cho sự phỏt triển của tế bào cũng như tạo cỏc sản phẩm thứ cấp của nú. Việc lựa chọn cỏc chất kớch thớch sinh trưởng thớch hợp nhất đối với mỗi loại thực vật là một khõu trong quỏ trỡnh nghiờn cứu tạo sinh khối [44], [119].
Ngoài 2 nhúm trờn, cỏc chất khỏc: acid gilberilic và cỏc ethylen... cũng cú thể được sử dụng để kớch thớch tăng tổng hợp hoạt chất [67].
- Cỏc biện phỏp kớch thớch làm tăng hàm lượng hoạt chất
Cỏc kỹ thuật phổ biến để tăng tớch lũy hoạt chất là: dựng cỏc chất kớch thớch sinh tổng hợp hoạt chất (elicitor) hoặc cỏc tiền chất cho quỏ trỡnh sinh tổng hợp hoạt chất, kỹ thuật nuụi cấy 2 pha, nghiệm phỏp gen kớch hoạt, bất động tế bào, nuụi cấy 2 giai đoạn... Trong đú, cỏc elicitor chất làm tăng hàm lượng hoạt chất thường được sử dụng. Elicitor là cỏc chất cú bản chất hoỏ học khỏc nhau từ nhiều nguồn gốc, cú tỏc dụng kớch thớch tạo cỏc sản phẩm chuyển hoỏ thứ cấp để chống đỡ lại cỏc mầm bệnh khi xõm nhập vào tế bào thực vật, trong đú cú việc kớch thớch làm tăng sinh tổng hợp cỏc hoạt chất. Bỡnh thường, hệ thống tự bảo vệ trong tế bào được khởi động khi cú tỏc nhõn cú hại tỏc động vào tế bào [22], [65].
Những chất cú khả năng kớch thớch khởi động hệ thống tự bảo vệ này gọi là cỏc elicitor. Elicitor liờn kết với receptor trờn màng tế bào. Cỏc tớn hiệu của elicitor được truyền đi thụng qua cỏc chất truyền tớn hiệu thứ cấp (kờnh ion, GTP, phõn tử oxy hoạt động, inositol 1,4,5 - trisphosphate, cỏc enzym, cỏc chất trung gian dẫn truyền ...) dẫn đến kết quả cuối cựng kớch thớch sinh tổng hợp cỏc sản phẩm chuyển hoỏ thứ cấp, nhằm bảo vệ tế bào, trong đú cú cỏc hoạt chất sinh học [65]. Elicitor được chia làm 2 loại:
+ Elicitor hữu sinh (biotic elicitor): gồm cỏc chất (nội sinh hay ngoại sinh) cú nguồn gốc từ cỏc cơ thể sống: thực vật, vi sinh vật, nấm... Elicitor ngoại sinh (exogenous elicitor) là những thành phần đó cú hoạt tớnh kớch thớch tổng hợp hoạt chất. Elicitor nội sinh (endogenous elicitor) là sản phẩm tương
tỏc của chớnh cỏc yếu tố gõy bệnh với tế bào thực vật sinh ra. Đõy là cỏc chất kớch thớch sinh tổng hợp hoạt chất thực sự [102].
+ Elicitor vụ sinh (abiotic elicitor): là cỏc chất cỏc yếu tố khụng cú nguồn gốc từ cơ thể sống gồm cỏc chất hoỏ học tổng hợp (acid salicylic, acid benzoic, acid ferulic, acid jasmonic...), cỏc yếu tố vật lý (ỏnh sỏng, tia tử ngoại, nhiệt độ ...), ion kim loại nặng và những tổn thương cơ học... [102].
Khi tiến hành nghiờn cứu sử dụng cỏc elicitor, cần phải lựa chọn được loại và nồng độ elicitor cũng như thời gian tiếp xỳc của từng loại elicitor thớch hợp cho từng loại tế bào.
- Cỏc nguyờn tố đa lượng
Bao gồm cỏc loại muối của nitơ, phospho, kali, calci, magnesi và sulfua. Đõy là cỏc nguyờn tố chớnh cần thiết cho sinh trưởng của thực vật bậc cao. Nếu cõy trồng tự nhiờn cần cỏc muối vụ cơ để sinh trưởng và phỏt triển, thỡ để nuụi cấy thành cụng những tế bào chưa biệt húa, đũi hỏi phải cung cấp đầy đủ nguồn nitơ và cỏc ion vụ cơ như phospho, kali, calci, magne, mangan và sulfua. Trong đú, nguồn nitơ thường chiếm tỷ lệ cao [85]. Nguồn nitơ được đưa vào dưới dạng cỏc muối amoni hoặc nitrat như NH4NO3, NaNO3 hoặc kết hợp với cỏc muối khỏc như NH4H2PO4 và Ca(NO3)2. Tuy nhiờn, việc cõn đối giữa tỷ lệ NH4+ /NO3- rất quan trọng, vỡ nú ảnh hưởng tới hàm lượng hoạt chất cú trong sinh khối tế bào [11]. Theo S. Lui và cs [86] trong sinh khối tế bào sõm Hoa Kỳ (Panax notoginseng Wall.) hàm lượng saponin tăng khi tỷ lệ NH4+/NO3- giảm. Nhưng nếu tăng lượng amoni quỏ cao cú thể gõy độc cho tế bào và hàm lượng saponin lại giảm.
- Cỏc nguyờn tố vi lượng
Bao gồm cỏc loại muối của sắt, kẽm, mangan, đồng, molybden và coban ở dạng vi lượng. Cỏc vi khoỏng chất là những thành phần khụng thể thiếu đối với tế bào thực vật. Cỏc chất này đúng vai trũ như là cỏc coenzym tham gia vào cỏc