khối tế bào thụng đỏ và hoạt chất
3.2.4.1. Kết quả nghiờn cứu xõy dựng TCCS của nguyờn liệu
Qua khảo sỏt phõn tớch cỏc chỉ tiờu của sinh khối thụng đỏ thu được cỏc kết quả như sau:
* Hỡnh thức cảm quan: Khối tế bào khụ, xốp, màu nõu, khụng cú nấm mốc, khụng cú mựi lạ.
* Độ ẩm: Cõn chớnh xỏc khoảng 1,000 g sinh khối tế bào thụng đỏ. Tiến hành theo phương phỏp mụ tả trong phụ lục 9.6-DĐVN IV. Kết quả xỏc định độ ẩm trong cỏc mẫu sinh khối tế bào thụng đỏ được trỡnh bày trong bảng 3.50 Bảng 3.50. Kết quả xỏc định độẩm trong sinh khối thụng đỏ Mẫu Khối lượng dược liệu ban đầu (g) Khối lượng dược liệu sau khi sấy khụ (g) Độẩm (%) 1 1,1124 1,0568 5,00 2 1,1920 1,1429 4,12 3 1,1154 1,0612 4,86 4 1,0256 0,9784 4,60 5 1,0325 0,9827 4,82 X ± SD 4,68 ± 0,34
Kết quả bảng 3.50 cho thấy độ ẩm trong sinh khối tế bào thụng đỏ là 4,68 ± 0,34%.
* Tro toàn phần: Cõn chớnh xỏc khoảng 1,500 g sinh khối, tiến hành xỏc định tro toàn phần theo phương phương phỏp mụ tả trong phụ lục 9.8 – DĐVN IV. Kết quả xỏc định tro toàn phần cú trong sinh khối tế bào thụng đỏ được trỡnh bày trong bảng 3.51.
Bảng 3.51. Kết quả xỏc định tro toàn phần của sinh khối thụng đỏ
Mẫu Khliệu ban ối lượng dđầu (g)ược Khối lượng tro (g) Tro toàn ph(%) ần
1 1,5235 0,0943 7,19 2 1,5795 0,0979 6,20 3 1,5987 0,1092 6,83 4 1,5654 0,1001 6,39 5 1,5901 0,0976 6,14 X ± SD 6,35 ± 0,28
Kết quả bảng 3.51 cho thấy khối lượng tro toàn phần trong sinh khối tế bào thụng đỏ là 6,35 ± 0,28%.
* Tro khụng tan trong acid: Cõn khoảng 1,500 g dược liệu, nung ở 4500C để thu được tro toàn phần. Tiếp tục thờm 25 ml dung dịch HCl 2M (TT), tiến hành theo phương phỏp mụ tả trong phụ lục 9.7 – DĐVN IV (phương phỏp 1). Kết quả xỏc định tro khụng tan trong acid trong sinh khối tế bào thụng đỏ được trỡnh bày trong bảng 3.52.
Bảng 3.52. Kết quả xỏc định tro khụng tan trong acid của sinh khối thụng đỏ
Mẫu Khối d(g) ược liệu Khối l(mg) ượng tro trong acid (%) Tro khụng tan
1 1,5235 2,7 0,13 2 1,5795 2,6 0,12 3 1,5987 3,3 0,15 4 1,5654 1,8 0,09 5 1,5901 2,5 0,09 X ± SD 0,11 ± 0,02
Kết quả bảng 3.52 cho thấy: khối lượng tro khụng tan trong acid trong dược liệu sinh khối thụng đỏ là 0,11 ± 0,02%.
* Định tớnh: Cõn khoảng 500 mg sinh khối tế bào thụng đỏ. Tiến hành định tớnh paclitaxel và baccatin III theo phương phỏp HPLC đó xõy dựng ở phần 3.2.1.1. Kết quả được thể hiện trờn sắc ký đồ hỡnh 3.20:
18 .6 26 31 .1 44 AU 0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 0.025 Minutes 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 32.00 34.00 36.00 38.00 40.00 18 .650 31 .1 31 AU 0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 0.025 Minutes 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 32.00 34.00 36.00 38.00 40.00
Hỡnh 3.20. Hỡnh ảnh sắc ký đồ của chuẩn (a) và mẫu sinh khối thụng đỏ (b)
Trờn hỡnh ảnh của sắc ký đồ của mẫu thử cho cỏc pớc thời gian lưu trựng với thời gian lưu của paclitaxel và baccatin III trong mẫu chuẩn.
* Định lượng:
- Cõn chớnh xỏc khoảng 0,5 g bột mịn sinh khối thụng đỏ, chiết bằng dung mụi methanol (10 ml x 3 lần). Tiếp tục làm theo phương phỏp đó mụ tả trong phần 3.2.1.1. Kết quả được trỡnh bày trong bảng 3.53.
Bảng 3.53. Kết quảđịnh lượng paclitaxel và baccatin III trong sinh khối tế
bào thụng đỏ Mẫu Khối lượng mẫu cõn (mg) Độẩm mẫu (%) Paclitaxel (%) Baccatin III (%) 1 524,5 4,98 0,0363 0,0065 2 498,6 5,04 0,0369 0,0057 3 516,7 4,97 0,0355 0,0062 4 505,2 4,45 0,0361 0,0063 5 501,9 4,69 0,0357 0,0058 6 517,4 4,87 0,0354 0,0061 X ± SD 0,0360±0,0006 0,0061 ±0,0003 a b
Hàm lượng paclitaxel và baccatin III trong sinh khối tế bào thụng đỏ lần lượt là 0,0360 và 0,0061%.
Từ kết quả trờn, đưa ra TCCS của sinh khối tế bào thụng đỏ như sau: * Nguồn gốc: Là khối tế bào thụng đỏ được tạo ra bằng cụng nghệ sinh khối tế bào thực vật từ nguồn thõn non thụng đỏ tự nhiờn (Taxus wallichiana
Zucc.). Sinh khối tế bào thụng đỏ thu hoạch từ hệ thống bioreactor, lọc, rửa, sấy khụ.
YấU CẦU CHẤT LƯỢNG
* Hỡnh thức: Khối tế bào khụ, xốp, màu nõu, khụng cú nấm mốc, khụng cú mựi lạ.
* Độẩm: khụng quỏ 12 %.
* Tro toàn phần: khụng quỏ 8%.
* Tro khụng tan trong acid: khụng quỏ 2%.
* Định tớnh: Phải thể hiện phộp thử định tớnh của paclitaxel và baccatin III.
* Định lượng:
+ Hàm lượng paclitaxel trong sinh khối tế bào thụng đỏ khụng ớt hơn 0,03%.
+ Hàm lượng baccatin III trong sinh khối tế bào thụng đỏ khụng ớt hơn 0,005%.
PHƯƠNG PHÁP THỬ
- Hỡnh thức: Kiểm tra bằng cảm quan, chế phẩm phải đạt cỏc yờu cầu đó
nờu.
- Độẩm: Thử theo DĐVN IV, phụ lục 9.6 (1g, 850C trong 5 giờ).
- Tro toàn phần: Lấy 1,5 g chế phẩm, tiến hành theo phương phỏp 1, phụ lục 9.8, DĐVN IV (nung ở 5000C).
- Tro khụng tan trong acid: theo phương phỏp 1, phụ lục 9.7, DĐVN IV.
Trong phần định lượng, sắc ký đồ của dung dịch thử phải cú cỏc pic cựng thời gian lưu với cỏc pic baccatin III và paclitaxel trong sắc ký đồ của cỏc dung dịch baccatin III và paclitaxel chuẩn.
- Định lượng: Phương phỏp HPLC (Phụ lục 5.3, DĐVN IV)
Hoỏ chất và thuốc thử:
- Acetonitril: loại dựng cho HPLC. - Methanol, n-hexan, diclorometan (TT). - Dung dịch natri clorid 5% (TT).
- Natri sulfat khan (TT).
Điều kiện sắc ký:
- Cột Phenomenex, Luna 5μm PFP 100 A0 (25cm x 4mm) hoặc cột tương đương
- Pha động: Hỗn hợp Acetonitril - nước với chương trỡnh dung mụi: Thời gian (phỳt) Dung mụi A Dung mụi B
0 - 45 25 - 62 75 - 38 45 - 55 62 - 25 38 - 75 55 - 65 25 75 - Tốc độ dũng: 1 ml/phỳt. - Detector UV ở bước súng 228 nm. - Thể tớch tiờm: 20 μl.
Chuẩn bị dung dịch thử và dung dịch chuẩn:
- Dung dịch thử:
Cõn chớnh xỏc khoảng 0,5 g chế phẩm đó nghiền mịn vào ống ly tõm 50 ml, , thờm 10 ml methanol, lắc xoỏy với tốc độ khoảng 1000 vũng/phỳt trong 5 phỳt, ly tõm với tốc độ 3000 vũng/phỳt trong 10 phỳt. Gạn lấy dịch ly tõm, cắn trong ống ly tõm được chiết như trờn 3 lần nữa, mỗi lần với 10 ml methanol. Gộp cỏc dịch ly tõm, chuyển vào bỡnh gạn đó cú sẵn 25 ml dung dịch natri clorid 5%, lắc đều. Rửa loại tạp bằng n-hexan 2 lần, mỗi lần 10 ml, gạn bỏ dịch chiết n-hexan. Lớp nước được lắc kỹ với dichlorometan 4 lần,
mỗi lần 15 ml. Gộp cỏc dịch chiết dichlorometan, lọc qua natri sulfat khan, sau khi lọc xong rửa lớp natri sulfat bằng vài ml dichloromethan. Gộp cỏc dịch lọc và dịch rửa dichloromethan, bốc hơi dung mụi ở 350Cdưới dũng khớ nitơ tới cắn. Hũa cắn vừa đủ trong 5 ml methanol. Lọc qua màng lọc 0,45μm được dung dịch tiờm sắc ký.
- Dung dịch chuẩn:
Dung dịch chuẩn baccatin III trong methanol cú nồng độ khoảng 5 μg trong 1 ml.
Dung dịch chuẩn paclitaxel trong methanol cú nồng độ khoảng 30 μg trong 1 ml.
Tiến hành:
Tiờm riờng biệt 20 μl cỏc dung dịch chuẩn và dung dịch thử vào hệ thống sắc ký, tiến hành sắc ký theo điều kiện đó mụ tả, ghi nhận sắc ký đồ, thời gian lưu và diện tớch của cỏc pic baccatin III và paclitaxel.
Hàm lượng (%) (KL/KL) baccatin III (hoặc paclitaxel) tớnh theo chế phẩm khụ kiệt được tớnh theo cụng thức:
At 5 100 100
X(%) = Ac x Cc 1000 x mt x 100-b
Trong đú:
At và Ac: Diện tớch pic baccatin III (hoặc paclitaxel) trong dung dịch thử và dung dịch chuẩn.
Cc: Nồng độ dung dịch baccatin III (hoặc paclitaxel) chuẩn (μg/ml). mt: Khối lượng của mẫu thử (mg).
b : Độ ẩm của bột (%).
ĐểNG GểI, GHI NHÃN, BẢO QUẢN
- Đúng gúi trong tỳi PE 2 lớp, dón nhón nguyờn liệu - Bảo quản nơi khụ mỏt.
Tiờu chuẩn cơ sở xõy dựng trong nghiờn cứu này đó được Viện Kiểm nghiệm Trung ương thẩm định ngày 01 thỏng 12 năm 2011 (Xem phụ lục 2).
3.2.4.2. Kết quả kiểm nghiệm paclitaxel theo USP 30
Sản phẩm paclitaxel đó được kiểm nghiệm chỉ tiờu định lượng theo USP 30 tại Trung tõm kiểm nghiệm Dược Hà Nội. Kết quả hàm lượng paclitaxel đạt 98,1% (Đạt yờu cầu của USP 30 - Phiếu kiểm nghiệm số 1290/11 ngày 16 thỏng 11 năm 2011 – (xem phụ lục). Như vậy, sản phẩm paclitaxel chiết xuất từ sinh khối tế bào thụng đỏ đạt yờu cầu về chỉ tiờu định lượng theo USP 30.
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN