CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. XÂY DỰNG QUY TRÌNH TẠO SINH KHỐI TẾ BÀO THÔNG ĐỎ
3.1.5. Kết quả nghiên cứu thu hoạch sinh khối tế bào thông đỏ
Sơ đồ quy trình thu hoạch sinh khối tế bào thông đỏ được mô tả trong hình 3.8.
Mô tả quy trình:
- Rút hỗn dịch sinh khối tế bào thông đỏ ra khỏi bình nuôi cấy và để lắng tự nhiên 1 giờ.
- Hỗn dịch nuôi cấy được lọc bằng máy hút chân không để thu lấy khối tế bào.
- Khối tế bào được hoà vào trong nước cất theo tỷ lệ 5 phần nước: 1 phần sinh khối tế bào, sau đó lọc loại bỏ phần nước rửa. Phần tế bào tiếp tục
được rửa thêm 2 lần nữa, thu được sinh khối thông đỏ là dạng bột màu nâu đậm và xốp.
- Bột sinh khối thông đỏ được sấy khô trong tủ sấy có quạt gió ở nhiệt độ 600C cho tới khối lượng không đổi.
- Kiểm nghiệm sản phẩm, đóng túi PE 02 lần, bảo quản nơi khô mát.
Hình 3.8. Sơ đồ quy trình thu hoạch sinh khối tế bào thông đỏ trong Bioreactor
* Kết quả thu hoạch 8 mẻ nuôi cấy tế bào thông đỏ trên hệ thống bình nuôi cấy 5 lít và xác định dư lượng NAA, BAP trong sinh khối, cũng như hàm lượng paclitaxel trong sản phẩm thu được trình bày trong bảng 3.28.
* Định lượng NAA trong sinh khối tế bào: Cân chính xác khoảng 1 g bột SKTB thông đỏ khô, thêm 20 ml nước và 4 ml NaOH 50%. Đun hồi lưu trong 3 giờ. Ly tâm, lấy phần dịch trong. Thêm 10 ml DCM, lắc trong 1 phút. Chờ phân lớp, lấy phần dịch nổi ở trên. Acid hoá bằng khoảng 3 – 4 ml HCl đặc tới pH <2.
Để nguội, chiết bằng 20 ml DCM x 2 lần. Dịch chiết DCM được làm khan bằng natri sulfat khan. Gộp dịch chiết DCM và đuổi dung môi bằng dòng nitơ nhẹ ở nhiệt độ 350C tới cắn. Thêm chính xác 10 ml DCM, lắc kỹ trong 1 phút. Lọc qua
Lọc qua giấy lọc
Kiểm nghiệm Sấy 600C /10 giờ
Rửa 3 lần bằng nước cất
Hỗn dịch nuôi cấy
Khối tế bào thô
Khối tế bào sạch
Khối tế bào khô
Sản phẩm
Môi trường thừa
Nước rửa
2 g natri sulfat khan. Bỏ khoảng 2 ml dịch lọc đầu. Hút chính xác 1 ml dịch lọc chuyển vào cột chiết pha rắn (silica gel 2g) để loại tạp. Rửa giải với 5 ml hỗn hợp 99%DCM 1% acid acetic x 3 lần. Lấy toàn bộ dịch rửa giải để đuổi dung môi hữu cơ bằng dòng khí nitơ tới cắn. Thêm chính xác 10 ml ACN 50% trong nước, lắc kỹ, lọc qua màng lọc 0,45 àm. Tiến hành sắc ký với điều kiện: cột SAX; 400C; pha động: MeCN: 0,025M KH2PO4 pH 5 (30:70, tt/tt); tốc độ dòng:
0,8 ml/phỳt; thể tớch tiờm mẫu: 20 àl; nhiệt độ buồng bơm mẫu 40C; detector huỳnh quang bước sóng 220 và 340 nm [4], [129].
* Định lượng BAP: Cân chính xác khoảng 1 g SKTB thông đỏ khô chiết hồi lưu bằng Soxhlet với 100 ml EtOH 95% trong 3 giờ. Dịch chiết EtOH được bốc hơi trong chân không tới cắn. Hòa tan cắn trong 8 ml đệm amoni formiat (0,01M, pH =3,7), sau đó loại tạp bằng cách chiết với ether ethylic 3 lần. Dung dịch đệm sau khi loại tạp được điều chỉnh về pH=5,6 với dung dịch NH4OH 5%. Loại tạp bằng cột chiết pha rắn rửa lần lượt với nước khử ion, dung dịch HCl 0,5N, dung dịch NaOH 0,5N. Rửa giải bằng 50 ml MeOH. Dịch rửa giải được đuổi dung môi hữu cơ bằng dòng khí nitơ tới cắn.
Hòa tan cắn trong 1ml MeOH để phân tích bằng HPLC. Tiến hành sắc ký với điều kiện: Cột C8; pha động: Nước : methanol (30 : 70 tt/tt), tốc độ dòng: 1,0 ml/phỳt; thể tớch tiờm mẫu: 6 àl. Detector PDA 255 nm [88].
Bảng 3.28. Kết quả phân tích dư lượng NAA, BAP và hàm lượng paclitaxel trong các mẻ nuôi cấy sinh khối thông đỏ
Mẻ cấy NAA
(ppm) BAP
(ppm) Hàm lượng paclitaxel
%(kl/kl)
Mẻ 1 1,22 0,51 0,0361
Mẻ 2 1,91 0,64 0,0354
Mẻ 3 1,20 0,57 0,0362
Mẻ 4 1,92 0,66 0,0368
Mẻ 5 1,89 0,71 0,0352
Mẻ 6 1,78 0,59 0,0384
Mẻ 7 1,94 0,67 0,0321
Mẻ 8 1,98 0,53 0,0386
x 1,73 0,61 0,0361
SD 0,13 0,07 0,0020
Sau 8 mẻ nuôi cấy trên hệ thống bioreactor 5 lít thì hàm lượng paclitaxel trong tế bào đạt 0,0361%. Dư lượng các chất kích thích sinh trưởng sử dụng trong quá trình nuôi cấy gồm NAA và BAP lần lượt là 1,73 và 0,61 ppm (khối lượng tế bào khô).
Mẫu sinh khối tế bào thông đỏ thu được đã kiểm nghiệm tại Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương và đạt yêu cầu các chỉ tiêu chất lượng theo TCCS trong đó hàm lượng paclitaxel và baccatin III lần lượt là 0,038% và 0,0061%
(số phiếu 42/TCH 01 ngày 01 tháng 12 năm 2011 – Xem phần phụ lục).
3.1.6. Quy trình tạo sinh khối tế bào thông đỏ
Từ các kết quả khảo sát thu được, đưa ra quy trình tạo sinh khối tế bào thông đỏ quy mô phòng thí nghiệm như sau (hình 3.9):
- Mẫu thân non thông đỏ tự nhiên được tiệt khuẩn bằng dung dịch HgCl2 0,07% + tween 80 (0,01%) trong thời gian 17 phút. Mẫu được cắt thành cách lát nhỏ. Cấy mẫu vào trong môi trường B5 có bổ sung NAA (2,0 mg/l), kinetin (0,2 mg/l), saccharose (20 g/l), pH=5,6, nhiệt độ 240C. Nuôi cấy không có ánh sáng trong 35 ngày để thu callus.
- Cấy chuyển callus 4 lần trong môi trường thạch SH có bổ sung NAA (2,0 mg/l), kinetin (0,2 mg/l), saccharose (20 g/l), pH=5,6, nhiệt độ 22-240C, thời gian 35 ngày để duy trì callus
- Cấy chuyển tế bào (tỷ lệ 20%) sang môi trường lỏng SH có bổ sung NAA (3,0 mg/l), BAP (2,0 mg/l), saccharose (30 g/l), pH = 5,6; điều kiện nuôi cấy: nhiệt độ 240C, tốc độ máy lắc 130 vòng/phút, thời gian 14 ngày.
- Cấy chuyển tế bào sang hệ thống bioreactor 5 lít trong môi trường SH có bổ sung NAA (3,0 mg/l), BAP (2,0 mg/l), saccharose (30 g/l), pH = 5,6;
điều kiện nuôi cấy: nhiệt độ 240C, đến ngày thứ 10 thêm saccharose (20 g/l), ngày thứ 12 bổ sung methyl jasmonat (100 àM), tiếp tục nuụi đến ngày thứ17 ngày, trong điều kiện không có ánh sáng. Lọc lấy tế bào, rửa sạch bằng nước cất 3 lần, sấy khô ở 600C trong 10 giờ được sản phẩm sinh khối tế bào thông đỏ.
Hình 3.9. Sơ đồ quy trình tạo sinh khối tế bào thông đỏ
Callus
SKTB/MT láng
- Môi tr−ờng SH +NAA (2mg/l), Ki (0,2mg/), saccharose (20g/l), pH=5,6.
- Nuôi trong điều kiện: t0= 22-240C; thời 35 ngày; không có ánh sáng. Cấy chuyển 4 lần Duy trì nuôi cấy trong
môi tr−ờng thạch
Thông đỏ tự nhiên
- Tiệt khuẩn mẫu cây bằng HgCl + Tween 80 - Cấy vào MT B5 + NAA (2mg/l), Ki (0,2mg/l),
saccharose (20g/l), pH=5,6.
- Điều kiện nuôi cấy: 35 ngày, nhiệt độ240C, không có ánh sáng
Tạo callus
Nuôi cấy
trên môi tr−ờng lỏng
- Môi tr−ờng SH + NAA (3mg/l), BAP (2mg/l), saccharose (30g/l).
- Điều kiện nuôi cấy: tỷ lệ mẫu cấy 20%; t0=240C;
pH=5,6; tốc độ cánh khuấy 130 v/phút, thời gian:14 ngày
Callus/MT thạch
Sinh khèi/ Bioreactor
- Lọc lấy tế bào - Rửa 3 lần với n−ớc cất - Sấy khô 40 -600C/10giờ Thu sinh khèi
SKTB khô
- Môi tr−ờng SH + NAA (3mg/l), BAP (2mg/l), saccharose (30g/l+20g/l ở ngày thứ 10), thêm MJ (100àM) ngày thứ 12
- Điều kiện nuôi cấy: tỷ lệ mẫu cấy 20%; t0=240C;
pH=5,6; tốc độ cánh khuấy 60 v/phút, nồng độ oxy hoà tan 30%; thời gian:17 ngày
Nuôi cấy trong hệ thèng bioreactor 5 lÝt
KNSP
3.2. KẾT QUẢ NGHIấN CỨU THÀNH PHẦN HểA HỌC, CHIẾT