Mẫu Khối lượng tinh thể thu được (mg) Hàm lượng Paclitaxel (%) Hiệu suất (%) 1 429,4 98,39 90,74 2 451,2 99,04 95,98 3 452,6 96,82 94,12 4 443,3 98,65 93,93 5 416,8 97,71 87,47 6 448,1 97,81 94,18 x ± SD 440,2 ± 14,25 98,07 ± 0,79 92,74 ± 3,09
Sau khi tinh chế bằng sắc ký cột lần thứ 2 hàm lượng paclitxel trong sản phẩm phẩm thu được đó tăng từ 93,11% (sản phẩm trước tinh chế) lờn 98,07 % và hiệu suất đạt 92,74%. Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm thu được bằng HPLC. Kết quả sắc ký đồ được trỡnh bày trong hỡnh 3.18 a và 3.18b.
Như vậy, quỏ trỡnh chiết xuất và tinh chế paclitaxel phải trải qua nhiều giai đoạn khỏc nhau, sau mỗi giai đoạn hàm lượng paclitaxel trong sản phẩm thu được đó tăng lờn đỏng kể. Tuy nhiờn, hiệu suất của quỏ trỡnh cũng giảm đi. Kết quả tổng hợp cỏc giai đoạn chiết xuất và tinh chế paclitaxel được trỡnh bày trong bảng 3.49.
Bảng 3.49. Kết quả tổng hợp về hiệu suất và hàm lượng paclitaxel qua cỏc giai đoạn chiết xuất, tinh chế
Giai đoạn chiết xuất tinh chế
Hàm lượng paclitaxel (%) Hiệu suất từng giai đoạn (%) Chiết xuất MeOH 0,50 ± 0,02 97,30 ± 0,56 Chiết xuất DCM 5,93 ± 0,25 91,94 ± 1,45 Loại tạp bằng than hoạt 7,81 ± 0,18 88,68 ± 2,58 Kết tủa trong n-hexan 25,37 ± 1,12 82,43 ± 1,76 Kết tủa trong MeOH: H2O 60,46 ± 1,05 71,41 ± 1,45 Tinh chế bằng sắc ký cột lần 1 93,11 ± 1,74 91,97 ± 2,61 Tinh chế bằng sắc ký cột lần 2 98,07 ± 0,97 92,74 ± 3,09 Cả quỏ trỡnh 98,07 39,83
Kết quả bảng 3.49 cho thấy: hiệu suất của cả quỏ trỡnh chiết xuất và tinh chế đạt 39,83%, trong khi hàm lượng sản phẩm cuối cựng đạt 98,07%.
Hỡnh 3.18. Sắc ký đồ cỏc mẫu paclitaxel
a. paclitaxel chuẩn b: paclitaxel chiết từ sinh khối (98,07%)
Trờn sắc ký đồ của paclitaxel chuẩn và thử khụng xuất hiện cỏc pớc lạ, thời gian lưu của paclitaxel của mẫu thử trựng với thời gian lưu của chuẩn.
Từ cỏc kết qủa nghiờn cứu, xõy dựng quy trỡnh chiết xuất và tinh chế paclitaxel từ sinh khối tế bào thụng đỏ được trỡnh bày trong sơ đồ hỡnh 3.19.
a
Hỡnh 3.19. Sơđồ chiết xuất, tinh chế paclitaxel từ SKTB thụng đỏ NaCl 5%, tỷ lệ 1:1 DCM, tỷ lệ 1:4(kl/tt) chiết lỏng lỏng, cụ dưới ỏp suất giảm, t0 Sinh khối Dịch chiết MeOH
Dich chiết MeOH Bó DL Dịch chiết DCM Dịch chiết DCM đó xử lý hấp phụ Than hoạt + tạp Dịch lọc Tủa thụ Dịch lọc Tinh thể Sắc ký cột 2l
Paclitaxel tinh khiết
Dung mụi MeOH, tỷ lệ 1:4(kl/tt)
Chiết siờu õm, 4 lần x 1h Lọc, cụ dưới ỏp suất giảm Than hoạt, tỷ lệ 3:1 Khuấy trong 30p Lọc, rửa, cụ dưới ỏp suất giảm, t0 phũng n-hexan, tỷ lệ 10:1 Khuấy Lọc thu tủa, sấy chõn khụng MeOH, tỷ lệ 0,5%(kl/tt) Nhỏ giọt nước cất pH 8, Khuấy Lọc thu tủa, sấy chõn khụng
3.2.4. Kết quả nghiờn cứu xõy dựng tiờu chuẩn cơ sở của nguyờn liệu sinh khối tế bào thụng đỏ và hoạt chất khối tế bào thụng đỏ và hoạt chất
3.2.4.1. Kết quả nghiờn cứu xõy dựng TCCS của nguyờn liệu
Qua khảo sỏt phõn tớch cỏc chỉ tiờu của sinh khối thụng đỏ thu được cỏc kết quả như sau:
* Hỡnh thức cảm quan: Khối tế bào khụ, xốp, màu nõu, khụng cú nấm mốc, khụng cú mựi lạ.
* Độ ẩm: Cõn chớnh xỏc khoảng 1,000 g sinh khối tế bào thụng đỏ. Tiến hành theo phương phỏp mụ tả trong phụ lục 9.6-DĐVN IV. Kết quả xỏc định độ ẩm trong cỏc mẫu sinh khối tế bào thụng đỏ được trỡnh bày trong bảng 3.50 Bảng 3.50. Kết quả xỏc định độẩm trong sinh khối thụng đỏ Mẫu Khối lượng dược liệu ban đầu (g) Khối lượng dược liệu sau khi sấy khụ (g) Độẩm (%) 1 1,1124 1,0568 5,00 2 1,1920 1,1429 4,12 3 1,1154 1,0612 4,86 4 1,0256 0,9784 4,60 5 1,0325 0,9827 4,82 X ± SD 4,68 ± 0,34
Kết quả bảng 3.50 cho thấy độ ẩm trong sinh khối tế bào thụng đỏ là 4,68 ± 0,34%.
* Tro toàn phần: Cõn chớnh xỏc khoảng 1,500 g sinh khối, tiến hành xỏc định tro toàn phần theo phương phương phỏp mụ tả trong phụ lục 9.8 – DĐVN IV. Kết quả xỏc định tro toàn phần cú trong sinh khối tế bào thụng đỏ được trỡnh bày trong bảng 3.51.
Bảng 3.51. Kết quả xỏc định tro toàn phần của sinh khối thụng đỏ
Mẫu Khliệu ban ối lượng dđầu (g)ược Khối lượng tro (g) Tro toàn ph(%) ần
1 1,5235 0,0943 7,19 2 1,5795 0,0979 6,20 3 1,5987 0,1092 6,83 4 1,5654 0,1001 6,39 5 1,5901 0,0976 6,14 X ± SD 6,35 ± 0,28
Kết quả bảng 3.51 cho thấy khối lượng tro toàn phần trong sinh khối tế bào thụng đỏ là 6,35 ± 0,28%.
* Tro khụng tan trong acid: Cõn khoảng 1,500 g dược liệu, nung ở 4500C để thu được tro toàn phần. Tiếp tục thờm 25 ml dung dịch HCl 2M (TT), tiến hành theo phương phỏp mụ tả trong phụ lục 9.7 – DĐVN IV (phương phỏp 1). Kết quả xỏc định tro khụng tan trong acid trong sinh khối tế bào thụng đỏ được trỡnh bày trong bảng 3.52.
Bảng 3.52. Kết quả xỏc định tro khụng tan trong acid của sinh khối thụng đỏ
Mẫu Khối d(g) ược liệu Khối l(mg) ượng tro trong acid (%) Tro khụng tan
1 1,5235 2,7 0,13 2 1,5795 2,6 0,12 3 1,5987 3,3 0,15 4 1,5654 1,8 0,09 5 1,5901 2,5 0,09 X ± SD 0,11 ± 0,02
Kết quả bảng 3.52 cho thấy: khối lượng tro khụng tan trong acid trong dược liệu sinh khối thụng đỏ là 0,11 ± 0,02%.
* Định tớnh: Cõn khoảng 500 mg sinh khối tế bào thụng đỏ. Tiến hành định tớnh paclitaxel và baccatin III theo phương phỏp HPLC đó xõy dựng ở phần 3.2.1.1. Kết quả được thể hiện trờn sắc ký đồ hỡnh 3.20:
18 .6 26 31 .1 44 AU 0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 0.025 Minutes 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 32.00 34.00 36.00 38.00 40.00 18 .650 31 .1 31 AU 0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 0.025 Minutes 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 32.00 34.00 36.00 38.00 40.00
Hỡnh 3.20. Hỡnh ảnh sắc ký đồ của chuẩn (a) và mẫu sinh khối thụng đỏ (b)
Trờn hỡnh ảnh của sắc ký đồ của mẫu thử cho cỏc pớc thời gian lưu trựng với thời gian lưu của paclitaxel và baccatin III trong mẫu chuẩn.
* Định lượng:
- Cõn chớnh xỏc khoảng 0,5 g bột mịn sinh khối thụng đỏ, chiết bằng dung mụi methanol (10 ml x 3 lần). Tiếp tục làm theo phương phỏp đó mụ tả trong phần 3.2.1.1. Kết quả được trỡnh bày trong bảng 3.53.
Bảng 3.53. Kết quảđịnh lượng paclitaxel và baccatin III trong sinh khối tế
bào thụng đỏ Mẫu Khối lượng mẫu cõn (mg) Độẩm mẫu (%) Paclitaxel (%) Baccatin III (%) 1 524,5 4,98 0,0363 0,0065 2 498,6 5,04 0,0369 0,0057 3 516,7 4,97 0,0355 0,0062 4 505,2 4,45 0,0361 0,0063 5 501,9 4,69 0,0357 0,0058 6 517,4 4,87 0,0354 0,0061 X ± SD 0,0360±0,0006 0,0061 ±0,0003 a b
Hàm lượng paclitaxel và baccatin III trong sinh khối tế bào thụng đỏ lần lượt là 0,0360 và 0,0061%.
Từ kết quả trờn, đưa ra TCCS của sinh khối tế bào thụng đỏ như sau: * Nguồn gốc: Là khối tế bào thụng đỏ được tạo ra bằng cụng nghệ sinh khối tế bào thực vật từ nguồn thõn non thụng đỏ tự nhiờn (Taxus wallichiana
Zucc.). Sinh khối tế bào thụng đỏ thu hoạch từ hệ thống bioreactor, lọc, rửa, sấy khụ.
YấU CẦU CHẤT LƯỢNG
* Hỡnh thức: Khối tế bào khụ, xốp, màu nõu, khụng cú nấm mốc, khụng cú mựi lạ.
* Độẩm: khụng quỏ 12 %.
* Tro toàn phần: khụng quỏ 8%.
* Tro khụng tan trong acid: khụng quỏ 2%.
* Định tớnh: Phải thể hiện phộp thử định tớnh của paclitaxel và baccatin III.
* Định lượng:
+ Hàm lượng paclitaxel trong sinh khối tế bào thụng đỏ khụng ớt hơn 0,03%.
+ Hàm lượng baccatin III trong sinh khối tế bào thụng đỏ khụng ớt hơn 0,005%.
PHƯƠNG PHÁP THỬ
- Hỡnh thức: Kiểm tra bằng cảm quan, chế phẩm phải đạt cỏc yờu cầu đó
nờu.
- Độẩm: Thử theo DĐVN IV, phụ lục 9.6 (1g, 850C trong 5 giờ).
- Tro toàn phần: Lấy 1,5 g chế phẩm, tiến hành theo phương phỏp 1, phụ lục 9.8, DĐVN IV (nung ở 5000C).
- Tro khụng tan trong acid: theo phương phỏp 1, phụ lục 9.7, DĐVN IV.
Trong phần định lượng, sắc ký đồ của dung dịch thử phải cú cỏc pic cựng thời gian lưu với cỏc pic baccatin III và paclitaxel trong sắc ký đồ của cỏc dung dịch baccatin III và paclitaxel chuẩn.
- Định lượng: Phương phỏp HPLC (Phụ lục 5.3, DĐVN IV)
Hoỏ chất và thuốc thử:
- Acetonitril: loại dựng cho HPLC. - Methanol, n-hexan, diclorometan (TT). - Dung dịch natri clorid 5% (TT).
- Natri sulfat khan (TT).
Điều kiện sắc ký:
- Cột Phenomenex, Luna 5μm PFP 100 A0 (25cm x 4mm) hoặc cột tương đương
- Pha động: Hỗn hợp Acetonitril - nước với chương trỡnh dung mụi: Thời gian (phỳt) Dung mụi A Dung mụi B
0 - 45 25 - 62 75 - 38 45 - 55 62 - 25 38 - 75 55 - 65 25 75 - Tốc độ dũng: 1 ml/phỳt. - Detector UV ở bước súng 228 nm. - Thể tớch tiờm: 20 μl.
Chuẩn bị dung dịch thử và dung dịch chuẩn:
- Dung dịch thử:
Cõn chớnh xỏc khoảng 0,5 g chế phẩm đó nghiền mịn vào ống ly tõm 50 ml, , thờm 10 ml methanol, lắc xoỏy với tốc độ khoảng 1000 vũng/phỳt trong 5 phỳt, ly tõm với tốc độ 3000 vũng/phỳt trong 10 phỳt. Gạn lấy dịch ly tõm, cắn trong ống ly tõm được chiết như trờn 3 lần nữa, mỗi lần với 10 ml methanol. Gộp cỏc dịch ly tõm, chuyển vào bỡnh gạn đó cú sẵn 25 ml dung dịch natri clorid 5%, lắc đều. Rửa loại tạp bằng n-hexan 2 lần, mỗi lần 10 ml, gạn bỏ dịch chiết n-hexan. Lớp nước được lắc kỹ với dichlorometan 4 lần,
mỗi lần 15 ml. Gộp cỏc dịch chiết dichlorometan, lọc qua natri sulfat khan, sau khi lọc xong rửa lớp natri sulfat bằng vài ml dichloromethan. Gộp cỏc dịch lọc và dịch rửa dichloromethan, bốc hơi dung mụi ở 350Cdưới dũng khớ nitơ tới cắn. Hũa cắn vừa đủ trong 5 ml methanol. Lọc qua màng lọc 0,45μm được dung dịch tiờm sắc ký.
- Dung dịch chuẩn:
Dung dịch chuẩn baccatin III trong methanol cú nồng độ khoảng 5 μg trong 1 ml.
Dung dịch chuẩn paclitaxel trong methanol cú nồng độ khoảng 30 μg trong 1 ml.
Tiến hành:
Tiờm riờng biệt 20 μl cỏc dung dịch chuẩn và dung dịch thử vào hệ thống sắc ký, tiến hành sắc ký theo điều kiện đó mụ tả, ghi nhận sắc ký đồ, thời gian lưu và diện tớch của cỏc pic baccatin III và paclitaxel.
Hàm lượng (%) (KL/KL) baccatin III (hoặc paclitaxel) tớnh theo chế phẩm khụ kiệt được tớnh theo cụng thức:
At 5 100 100
X(%) = Ac x Cc 1000 x mt x 100-b
Trong đú:
At và Ac: Diện tớch pic baccatin III (hoặc paclitaxel) trong dung dịch thử và dung dịch chuẩn.
Cc: Nồng độ dung dịch baccatin III (hoặc paclitaxel) chuẩn (μg/ml). mt: Khối lượng của mẫu thử (mg).
b : Độ ẩm của bột (%).
ĐểNG GểI, GHI NHÃN, BẢO QUẢN
- Đúng gúi trong tỳi PE 2 lớp, dón nhón nguyờn liệu - Bảo quản nơi khụ mỏt.
Tiờu chuẩn cơ sở xõy dựng trong nghiờn cứu này đó được Viện Kiểm nghiệm Trung ương thẩm định ngày 01 thỏng 12 năm 2011 (Xem phụ lục 2).
3.2.4.2. Kết quả kiểm nghiệm paclitaxel theo USP 30
Sản phẩm paclitaxel đó được kiểm nghiệm chỉ tiờu định lượng theo USP 30 tại Trung tõm kiểm nghiệm Dược Hà Nội. Kết quả hàm lượng paclitaxel đạt 98,1% (Đạt yờu cầu của USP 30 - Phiếu kiểm nghiệm số 1290/11 ngày 16 thỏng 11 năm 2011 – (xem phụ lục). Như vậy, sản phẩm paclitaxel chiết xuất từ sinh khối tế bào thụng đỏ đạt yờu cầu về chỉ tiờu định lượng theo USP 30.
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN
4.1. QUY TRèNH TẠO SINH KHỐI TẾ BÀO THễNG ĐỎ 4.1.1. Về nuụi cấy tạo callus thụng đỏ 4.1.1. Về nuụi cấy tạo callus thụng đỏ
Trong sinh khối tế bào thực vật, giai đoạn tạo callus đúng vai trũ quyết định tới thành cụng của cả quy trỡnh. Nếu tạo được dũng callus phỏt triển tốt, khụng bị biệt húa, khả năng sinh hoạt chất cao sẽ gúp phần quan trọng tới năng suất và hiệu quả của quy trỡnh sinh khối. Vỡ vậy, cần phải nghiờn cứu cỏc điều kiện để tạo ra callus tốt sử dụng cho cỏc bước tiếp theo của quy trỡnh sinh khối tế bào thực võt. Để tạo được callus cú thể sử dụng nhiều loại mụ ở cỏc bộ phận khỏc nhau. Thụng thường hay sử dụng cỏc mụ non như đỉnh sinh trưởng, rẽ non, lỏ non, cành non [87], điều này gúp phần cho callus tạo ra phỏt triển nhanh hơn so với cỏc mụ lấy tại cỏc bộ phận tế bào già. Đối với tế bào thụng đỏ, cỏc nghiờn cứu trờn thế giới thường sử dụng cành non, lỏ non và hạt, tuy nhiờn cành non là bộ phận hay được sử dụng hơn cả [48]. Trong luận ỏn này, sử dụng bộ phận đưa vào nuụi cấy là cành non thụng đỏ.
4.1.1.1. Về lựa chọn chất sỏt khuẩn và thời gian tiệt khuẩn mẫu cấy
Nghiờn cứu tạo callus là quỏ trỡnh tỏch và cấy chuyển cỏc mụ, tế bào từ cõy tự nhiờn vào nuụi cấy trong điều kiện vụ khuẩn. Vỡ vậy, việc vụ khuẩn mẫu cấy quyết định tới sự thành bại của cụng nghệ. Để đảm bảo độ vụ khuẩn cho mẫu nuụi cấy, ngoài việc kiểm soỏt độ vụ khuẩn của mụi trường, dụng cụ và thiết bị nuụi cấy thỡ việc lựa chọn chất tiệt khuẩn và thời gian tiệt khuẩn thớch hợp là rất quan trọng, nhằm làm giảm thiểu tối đa mẫu cấy bị nhiễm vi khuẩn và vi nấm, đồng thời cũng giảm cả tỷ lệ mẫu bị chết do nhiễm độc cỏc chất sỏt khuẩn. Kết quả nghiờn cứu cho thấy khi sử dụng chất sỏt khuẩn HgCl2 nồng độ 0,07% kết hợp với chất hoạt động bề mặt tween 80 cho hiệu quả tiệt khuẩn tốt nhất với tỷ lệ tạo thành callus khụng bị nhiễm khuẩn là 38% (bảng 3.1). Kết quả này cũng phự hợp với nghiờn cứu của Fornalố và cs khi tiệt khuẩn mẫu cấy thụng đỏ Chõu Âu cũng sử dụng HgCl2 kết hợp với tween 20 [52].
Về thời gian tiệt khuẩn mẫu cấy thụng đỏ, khi tiệt khuẩn quỏ lõu mẫu cấy sẽ hạn chế bị nhiễm khuẩn hơn, tuy nhiờn tỷ lệ khụng tạo thành callus cũng tăng lờn. Điều này được giải thớch là do thời gian tiếp xỳc dài với chất sỏt khuẩn sẽ làm mẫu bị ngộ độc chất sỏt khuẩn gõy thõm đen và chết sau 5- 10 ngày nuụi cấy. Kết quả khảo sỏt ảnh hưởng của thời gian tiệt khuẩn cho thấy mẫu thụng đỏ khi tiệt khuẩn 17 phỳt thỡ tỷ lệ tạo thành callus trong mụi trường thạch là cao nhất đạt 45% (Bảng 3.2). Kết quả này cũng phự hợp với cỏc kết quả nghiờn cứu của cỏc tỏc giả về việc sử dụng HgCl2 để tiệt khuẩn mẫu cấy thực vật như nuụi cấy tế bào sõm Ngọc Linh, tế bào dừa cạn [7].
4.1.1.2. Về lựa chọn mụi trường tạo callus thụng đỏ
Mỗi loại thực vật đều cần một mụi trường thớch hợp để nuụi cấy sinh khối tế bào núi chung và tạo callus núi riờng. Cỏc loại sõm thường sử dụng mụi trường MS để nuụi cấy, trong khi nuụi cấy callus dừa cạn hay sử dụng mụi trường SH hoặc B5 [7]. Trong nghiờn cứu này, 4 loại mụi trường thụng dụng đó được khảo sỏt để tạo sinh khối tế bào thực vật và đỏnh giỏ kết quả tạo thành callus thụng đỏ. Kết quả khảo sỏt cho thấy mụi trường Gamborg (B5) cho tỷ lệ tạo callus cao nhất 73%, mụi trường Murashige - Skoog (MS) cho tỷ lệ thấp nhất 12% (Bảng 3.4). Tốc độ phỏt triển của tế bào trờn mụi trường B5 cũng cao hơn trờn cỏc mụi trường khỏc (Bảng 3.5). Hỡnh thỏi callus thụng đỏ trờn cỏc mụi trường khỏc nhau cũng khụng giống nhau. Callus mọc trong mụi trường B5 và SH, tế bào màu vàng nhạt, tươi và sỏng khụng bị nhiễm khuẩn. Callus mọc trờn mụi trường MS và White màu nõu sẫm và tế bào phỏt triển chậm (Hỡnh 3.2). Kết quả này cũng phự hợp với nghiờn cứu về lựa chọn mụi trường B5 cho tạo callus thụng đỏ Thỏi Bỡnh Dương (T. brevifolia) với tỷ lệ khoảng 75%, thụng đỏ Chõu Âu (T. baccata) tỷ lệ 30%, thụng đỏ Nhật Bản (T. cuspidata) tỷ lệ trờn 50% của Wickremesinhe và Arteca [48], nuụi cấy tạo callus thụng đỏ Trung Quốc (T. chinensis) của Luo và cs [91]. Từ kết quả khảo sỏt lựa chọn mụi trường B5 cho nuụi cấy tạo callus thụng đỏ.
4.1.1.3. Về thời gian chu kỳ nuụi cấy callus thụng đỏ