* Nguồn: theo Alan H.S. (1992) [18]
- Pha tiềm tàng hay cũn gọi là pha thớch nghi (lag phase): tại pha này, cỏc tế bào thực vật gần như khụng phỏt triển, nú đang thớch nghi với điều kiện và mụi trường nuụi cấy mới.
Pha thớch ghi Pha phỏt triển Pha dừng Pha ly giải
Thời gian (ngày)
Khối lượng tế bào (g)
- Pha phỏt triển (exponent phase): ở pha này cỏc tế bào đó trải qua thời gian thớch nghi và bắt đầu phỏt triển với tốc độ theo hàm lũy thừa, khối tế bào phỏt triển nhanh tạo ra một lượng lớn. Trong giai đoạn này nếu cung cấp đầy đủ chất dinh dưỡng, tế bào cú thể phỏt triển tối đa.
- Pha dừng (stationary phase): cỏc tế bào gần như khụng phỏt triển và nhõn lờn nữa. Lượng tế bào trong mụi trường tiến dần tới hằng định. Trong pha này, cỏc tế bào thực vật bắt đầu tổng hợp cỏc chất chuyển hoỏ thứ cấp. Pha này càng dài, lượng hoạt chất trong khối tế bào càng cao. Vỡ vậy, cần phải cung cấp đầy đủ chất dinh dưỡng để duy trỡ sự tồn tại của tế bào, nhằm kộo dài thời gian sinh tớch lũy cỏc sản phẩm thứ cấp [119], [125].
- Pha ly giải hay pha suy tàn (death phase, lysis phase): trong pha này cỏc tế bào thực vật bắt đầu chết dần, lượng tế bào giảm. Biểu hiện bờn ngoài là thay đổi màu sắc tế bào và mụi trường nuụi cấy, pH mụi trường thay đổi. Như vậy, cần phải xỏc định điểm kết thỳc của quỏ trỡnh nuụi cấy, đú là thời điểm trước khi chuyển sang pha ly giải. Khi đú sẽ thu được khối lượng tế bào lớn nhất, hàm lượng hoạt chất cao nhất và khụng bị lóng phớ mụi trường [9].
* Nhiệt độ nuụi cấy
Nhiệt độ nuụi cấy cú ảnh hưởng quan trọng tới sự phỏt triển khối tế bào thực vật và sự hỡnh thành cỏc chất chuyển hoỏ thứ cấp. Mỗi loại tế bào thực vật cú một khoảng nhiệt độ thớch nghi nhất định. Nhiệt độ quỏ thấp sẽ làm tế bào ngừng phỏt triển hoặc chết đi, nhiệt độ quỏ cao sẽ gõy chết tế bào. Trong khoảng nhiệt độ tồn tại của tế bào thực vật, thường cú một nhiệt độ tối ưu. Tại nhiệt độ này, sự phỏt triển của khối tế bào đạt tốc độ tối đa. Tuy nhiờn, khỏc với vi khuẩn và vi nấm, tế bào thực vật thường thớch nghi ở khoảng nhiệt độ thấp từ 20 - 280C [7], [69].
* pH mụi trường nuụi cấy
Ảnh hưởng của pH đến sự phỏt triển của tế bào và sinh tổng hợp của hoạt chất sinh học vẫn chưa được nghiờn cứu đầy đủ. Tuy nhiờn, mụ thực vật cú khả năng thớch nghi lớn với sự thay đổi của pH. Trong mụi trường nuụi
cấy, pH cú thể được điều chỉnh bằng chớnh cỏc tế bào thực vật để tối ưu hoỏ mụi trường nuụi cấy. pH cú ảnh hưởng tới sự phỏt triển của tế bào và sự tổng hợp cỏc chất chuyển hoỏ thứ cấp [32], [55].
* Nồng độ oxy hoà tan
Nhỡn chung, sự phỏt triển của tất cả cỏc tế bào hiếu khớ đều cần sự cú mặt của oxy. Oxy cần thiết cho quỏ trỡnh hụ hấp của tế bào, phõn cắt cỏc phõn tử hữu cơ tạo năng lượng cho cỏc quỏ trỡnh phỏt triển của cơ thể sinh vật. Tốc độ phỏt triển của tế bào thực vật càng cao càng cần nhiều oxy. Trong thực tế, cỏc tế bào thực vật phỏt triển tương đối chậm, chớnh vỡ vậy nồng độ oxy cung cấp cho tế bào khụng cần cao [37], [119].
1.3. SINH KHỐI TẾ BÀO THễNG ĐỎ SẢN XUẤT PACLITAXEL 1.3.1. Nhu cầu nguồn nguyờn liệu paclitaxel trong điều trị ung thư
Paclitaxel là một trong những loại thuốc chống ung thư thành cụng nhất được phỏt triển trong 50 năm qua. Bỡnh quõn mỗi năm doanh số bỏn hàng trờn toàn thế giới của paclitaxel trờn 1,5 tỷ USD - số liệu năm 1999 của Bristol Myers Squibb (cụng ty độc quyền nhón hiệu Taxol). Tuy nhiờn nếu như paclitaxel chỉ được chiết xuất từ cỏc loài thụng đỏ thỡ khụng thể đỏp ứng được nhu cầu điều trị ung thư cho nhõn loại bởi: thụng đỏ là loại cõy cú tốc độ sinh trưởng chậm, mỗi năm bỡnh quõn cõy phỏt triển thờm từ 2-3 cm đường kớnh, khụng những thế hàm lượng hoạt chất trong cõy rất thấp (0,001-0,05%). Để được 1 kg hoạt chất cần 10.000 kg vỏ cõy hoặc 3000 cõy thụng đỏ [125] và điều trị một bệnh nhõn ung thư khỏi bệnh cần chặt hạ khoảng tỏm cõy thụng đỏ 60 tuổi. Ngoài ra, chiết xuất paclitaxel cũng đũi hỏi một hệ thống thiết bị phức tạp và kỹ thuật tinh chế đặc hiệu sử dụng cụng nghệ tiờn tiến và đắt tiền. Trong khi việc tổng hợp toàn phần paclitaxel và cỏc chất dẫn chất chỉ mang giỏ trị khoa học mà khụng cú giỏ trị ứng dụng thực tiễn do cỏc hợp chất này cú cấu trỳc hoỏ học phức tạp gồm nhiều loại đồng phõn như hỡnh học, quang học [61]. Cho tới nay mới chỉ nghiờn cứu việc bỏn tổng hợp paclitaxel và docetaxel từ cỏc chất trung gian như baccatin III hoặc 10-deacetylbaccatin III
chiết xuất trong lỏ của cỏc loài Taxus. Với những khú khăn trờn, việc tạo ra được nguồn paclitaxel và cỏc dẫn chất tương tự thay thế cú tớnh ổn định, bền vững và thõn thiện với mụi trường là rất cần thiết. Cụng nghệ sinh khối tế bào thực vật là phương phỏp cú nhiều lợi thế bởi: cụng nghệ khụng phải chịu ảnh hưởng của thời tiết, mựa hoặc lõy nhiễm, thời gian tạo nguồn ngắn, hàm lượng hoạt chất cú thể được cải thiện so với nuụi trồng tự nhiờn [130]. Đõy là cụng nghệ đang được ứng dụng phổ biến trong sản xuất paclitaxel và cỏc dẫn chất từ tế bào cỏc loài thụng đỏ (Taxus sp.).
1.3.2. Sản xuất paclitaxel bằng cụng nghệ sinh khối tế bào thực vật
Hiện nay cụng nghệ sinh khối tế bào thực vật đó ỏp dụng trong nghiờn cứu và sản xuất paclitaxel từ cỏc loài thụng đỏ. Trong nhiều thập kỉ qua, cỏc nghiờn cứu về sinh tổng hợp paclitaxel và cỏc dẫn chất bằng việc nuụi cấy tế bào cỏc loài thụng đỏ đó được tiến hành như T. brevifolia, T. baccata, T. cuspidata, T. chinensis, T. canadensis, T. yunnanensis, T. x media. Trong đú điển hỡnh là cỏc nghiờn cứu về con đường sinh tổng hợp hoạt chất cũng như cỏc biện phỏp nhằm cải thiện hàm lượng paclitaxel trong sinh khối như: tối ưu húa điều kiện nuụi cấy, sàng lọc cỏc dũng tế bào cú khả năng sinh hoạt chất cao, tối ưu húa mụi trường nuụi cấy, cỏc biện phỏp kớch thớch tăng sinh tổng hợp hoạt chất như sử dụng cỏc chất kớch thớch sinh hoạt chất và cỏc tiền chất, cũng như kỹ thuật nuụi hai pha, nuụi cấy hai giai đoạn và kỹ thuật bất động tế bào [119], [125].
1.3.2.1. Con đường sinh tổng hợp paclitaxel
Paclitaxel được hỡnh thành chủ yếu từ nguyờn liệu ban đầu là cỏc phõn tử geranylgeranyl diphosphat (GGPP) gồm nhiều giai đoạn [125] (hỡnh 1.5).
Việc nghiờn cứu tỡm ra con đường sinh tổng hợp paclitaxel trong thụng đỏ, gúp phần cung cấp cỏc hiểu biết về phản ứng cũng như cỏc enzyme tham gia phản ứng. Từ đú giỳp cỏc nhà khoa học nghiờn cứu cỏc biện phỏp kớch
hoạt làm tăng sinh tổng hợp paclitaxel như: sử dụng tiền chất phenylalanine, sử dụng elicitor, cỏc chất kớch hoạt enzym [41], [125].