CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. XÂY DỰNG QUY TRÌNH TẠO SINH KHỐI TẾ BÀO THÔNG ĐỎ
3.1.2. Duy trì nuôi cấy callus thông đỏ trong môi trường thạch
Sau khi callus đã tạo trong môi trường thạch mềm, các tế bào còn cứng và tiếp tục biệt hóa thành các cơ quan tổ chức khác như thân, rễ… Vì vậy, cần có giai đoạn duy trì nuôi cấy trong môi trường thạch trong một thời gian nhất định, đảm bảo tế bào không còn biệt hóa, ngoài ra tế bào phải có hình thái mềm, xốp thích hợp cho việc nuôi cấy trong môi trường lỏng.
3.1.2.1. Ảnh hưởng của môi trường và số lần cấy chuyển
Tiến hành cấy chuyển callus (khoảng 5 g) từ môi trường thạch B5 sang môi trường B5 và SH có bổ sung chất kích thích sinh trưởng NAA (2,0 mg/l) và kinetin (0,2 mg/l), saccharose (20 g/l). Tiến hành cấy chuyển 4 lần (mỗi lần nuụi cấy là 35 ngày). Sau cỏc lần cấy chuyển, theo dừi hỡnh thỏi, tớnh chất
biệt hóa của tế bào và xác định tỷ lệ tăng trưởng. Kết quả được trình trong hình 3.4 và hình 3.5.
Hình 3.4. Hình ảnh callus thông đỏ ở 2 môi trường khác nhau
(a) – Môi trường B5 (b) – Môi trường SH
Hình 3.5. Callus thông đỏ sau các lần cấy chuyển trong môi trường thạch SH A: cấy chuyển lần 1; B: cấy chuyển lần 2; C: cấy chuyển lần 3,
D: cấy chuyển lần 4; E,F: cấy chuyển lần 5
Callus thông đỏ duy trì nuôi cấy trong môi trường thạch B5 tế bào phát triển chậm, thậm chí còn bị chết, một số bị biệt hoá thành mầm và chồi (hình 3.4). Trong khi các tế bào nuôi cấy ở môi trường SH tế bào phát triển tốt, không có hiện tượng biến màu (hình 3.5). Như vậy, SH là môi trường phù hợp
D E F
A B C
a b
với sự phát triển callus thông đỏ ở giai đoạn duy trì nuôi cấy. Kết quả nghiên cứu cấy chuyển nhiều lần của callus thông đỏ trong môi trường SH được trình bày trong bảng 3.9.
Bảng 3.9. Đặc tính của tế bào sau các lần cấy chuyển trong môi trường SH
Lần cấy
chuyển Hình thái tế bào Khả năng biệt hóa
Tỷ lệ tăng trưởng
(lần) Lần 1 Tế bào cứng Biệt hóa thành mầm, thân 1,87 Lần 2 Tế bào cứng, có một số
đã mềm mại
Biệt hóa thành các mô
sẹo 2,25
Lần 3 Tế bào mềm mại Không còn biệt hóa 2,78 Lần 4 Tế bào mềm mại, xốp Không còn biệt hóa 3,51 Lần 5 Tế bào mềm mại, xốp Không còn biệt hóa 3,72
Kết quả ở bảng 3.9 cho thấy: ở lần cấy chuyển đầu tiên, tế bào còn cứng, một số có dấu hiệu biệt hóa thành các cơ quan chuyên biệt như rễ, thân.
Sau lần cấy thứ 2, 3 các tế bào đã ít biệt hóa hơn. Tuy nhiên, tế bào vẫn chưa mềm mại. Tiếp tục cấy chuyển đến lần thứ 4 và 5 thì tế bào hoàn toàn không còn khả năng biệt hóa, các tế bào mềm, xốp, khối lượng tế bào tăng nhiều.
Tốc độ sinh trưởng của tế bào qua các lần cấy chuyển cũng thay đổi. Ở những lần cấy chuyển thứ nhất, tế bào phát triển chậm. Tuy nhiên, các lần cấy chuyển tiếp thứ 4 và 5 tốc độ tế bào phát triển nhanh và ổn định hơn với tỷ lệ tăng trưởng lần lượt là 3,51 và 3,72 lần. Như vậy, tế bào thông đỏ sau lần cấy chuyển thứ 5 thì tốc độ phát triển ổn định và không bị biệt hoá thành các mô, cơ quan.
3.1.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ saccharose
Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nồng độ saccharose trong môi trường SH bổ sung NAA (2,0 mg/l) và kinetin (0,2 mg/l.) Khảo sát ở các nồng độ 10;
15; 20; 25; 30; 35 và 40 g/l. Sau 35 ngày nuôi cấy, kết quả được trình bày trong bảng 3.10.
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự phát triển callus
STT
Nồng độ saccharose
(g/l)
số mẫu cấy
Khối lượng callus (g)
(x±SD)
Tỷ lệ tăng trưởng
(lần)
p
1 10 10 1,16 ± 0,15 2,48 p3-1<0,05 2 15 10 1,25 ± 0,13 2,65 p3-2<0,05
3 20 10 1,75 ± 0,16 3,72 *
4 25 10 1,54 ± 0,13 3,29 p3-4<0,05 5 30 10 1,26 ± 0,11 2,68 p3-5<0,05 5 35 10 1,22 ± 0,14 2,60 p3-6<0,05 7 40 10 1,12 ± 0,13 2,38 p3-7<0,05 Kết quả bảng 3.10 cho thấy: khi nuôi cấy callus trong môi trường thạch ở nồng độ saccharose 20 g/l, tốc độ phát triển của callus tốt nhất (p<0,05) với tốc độ tăng trưởng đạt 3,72 lần.
3.1.2.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy
Để đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy tới tốc độ phát triển của callus, sử dụng môi trường nuôi cấy SH có bổ sung NAA (2,0 mg/l), kinetin (0,2 mg/l) và saccharose (20 g/l), pH = 5,6. Tiến hành nuôi cấy trong điều kiện không có ánh sáng trong thời gian 35 ngày, ở các khoảng nhiệt độ từ 18 đến 280C. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.11.
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tốc độ phát triển tế bào STT Nhiệt độ
( 0C )
Số mẫu
cấy
Khối lượng callus (g)
(x±SD)
Tỷ lệ tăng trưởng
(lần)
p 1 18 – 20 10 1,25 ± 0,11 2,46 p3-1 <0,05 2 20 – 22 10 1,38 ± 0,15 3,04 p3-2 <0,05 3 22 – 24 10 1,77 ± 0,44 3,72 * 4 24 – 26 10 1,42 ± 0,12 3,11 p3-4<0,05 5 26 – 28 10 1,18 ± 0,14 2,62 p3-5<0,05
Kết quả bảng 3.11 cho thấy khối lượng callus thông đỏ trong nhóm nuôi cấy ở khoảng nhiệt độ từ 22-240C cao hơn các nhóm khác (p<0,05) với tỷ lệ tăng trưởng đạt 3,72 lần. Như vậy, nhiệt độ phù hợp cho giai đoạn nuôi cấy tạo callus và duy trì callus thông đỏ khoảng 22-240C.
3.1.2.4. Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy
Để đánh giá ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến tốc độ phát triển của tế bào thông đỏ trong giai đoạn duy trì nuôi cấy trong môi trường thạch mềm, sử dụng môi trường nuôi cấy SH có bổ sung NAA (2,0 mg/l), kinetin (0,2 mg/l), saccharose (20 g/l) và ở môi trường có pH là 5,0; 5,3; 5,6; 5,9; 6,2 và 6,5. Kết quả được trình bày ở bảng 3.12.
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của pH môi trường tới sự phát triển của callus STT pH
Số mẫu
cấy
Khối lượng callus (g)
(x±SD)
Tỷ lệ tăng trưởng
(lần)
p 1 5,0 10 0,96 ± 0,09 2,14 p3-1 < 0,05 2 5,3 10 1,41 ± 0,11 2,98 p3-2 < 0,05
3 5,6 10 1,79 ± 0,14 3,79 *
4 5,9 10 1,62 ± 0,13 3,44 p3-4< 0,05 5 6,2 10 1,28 ± 0,09 2,74 p3-5 < 0,05 6 6,5 10 0,68 ± 0,07 1,55 p3-6 < 0,05 Kết quả bảng 3.12 cho thấy: tốc độ phát triển của callus thông đỏ ở môi trường có pH 5,6 là cao nhất với tỷ lệ sinh trưởng đạt 3,79 lần (p < 0,05). Ở môi trường có pH 6,5, tế bào không phát triển, chuyển mầu nâu sẫm và có hiện tượng tế bào bị chết.