2.2.1. Thu mẫu và cố định mẫu
Các mẫu tôm bệnh đã bộc lộ dấu hiệu đỏ thân được thu từ các ao đã có hiện tượng chết. Mỗi ao thu từ 25-30 con tôm bệnh có dấu hiệu đỏ thân nhưng còn sống. Do nhiều phương pháp phân tích đã được sử dụng, nên tôm bệnh thu từ ao được cố định và xử lý theo các cách khác nhau: 5 con tôm bệnh của mỗi ao được vận chuyển sống về đến Phòng thí nghiệm Bệnh học Thủy sản để phân lập vi khuẩn và kiểm tra ký sinh trùng, 10 con tôm bệnh được cố định vào 2 lọ đựng cồn ethanol 95% (5 con/lọ mẫu) dùng cho phân tích PCR và RT-PCR. Số tôm còn lại được tiêm dung dịch Davidson (cồn 95%: 330 ml, Formol 40%: 220 ml, acid Acetic: 115 ml và nước cất
335 ml) vào phần đầu ngực (2ml/con), sau đó cố định chúng trong chính dung dịch này với tỷ lệ về thể tích là 1/10, sau 36-48h các mẫu này được chuyển sang cồn ethanol 70% để bảo quản rồi dùng cho phân tích mô bệnh học. 10 con tôm chưa bộc lộ bệnh lý trong mỗi ao cũng đã được thu cho phân tích đối chứng so sánh. Tơ mang của tôm bệnh thu từ 3 ao bệnh được cố định trong dung dịch Glutaraldehyde với tỷ lệ về thể tích mẫu với dung dịch là 1:10, giữ mát trong đá khô để gửi đến phân tích tại phòng kính hiển vi điện tử.
Ngoài ra, tôm bệnh cũng được thu (1kg) và cấp đông ở nhiệt độ -200C trong 3 tuần dùng để làm vật liệu cho thí nghiệm trong điều kiện in vivo. Tôm khỏe dùng cho thí nghiệm cảm nhiễm được chuyển về trại bằng phương pháp vận chuyển kín, sau khi đã có kết quả âm tính với tác nhân gây bệnh bằng kỹ thuật PCR.
2.2.2. Sơ đồ khối các nội dung đã nghiên cứu của luận văn
2.2.3. Các phương pháp nghiên cứu chính đã sử dụng
Để thực hiện được các nội dung đã nêu ra trong hình 2.1, có nhiều phương pháp nghiên cứu bệnh ở động vật thủy sản đã được sử dụng để thực hiện trong luận văn này.
Cảm nhiễm trong điều kiện in vivo Các dấu hiệu chính của bệnh Vi khuẩn
Nghiên cứu tác nhân gây hội chứng chết đỏ trên tôm chân trắng
(Litopenaeus vannamei Boon, 1931) nuôi thương phẩm tại Khánh Hòa
Các dấu hiệu chính có ý nghĩa chẩn đoán
bệnh
Phát hiện các vi sinh vật cảm nhiễm trên các mẫu tôm bị
bệnh đỏ Thử nghiệm cảm nhiễm để tìm tác nhân gây bệnh Trạng thái hoạt động của tôm bệnh Kết luận và đề xuất ý kiến Virus Ký sinh trùng
2.2.3.1. Phương pháp mô bệnh học (Histopathology method)
Để nghiên cứu các biến đổi bệnh lý trong mô và tế bào của các tổ chức của tôm bệnh và góp phần xác định khả năng nhiễm các loại virus thường gặp ở tôm biển, phương pháp mô học ứng dụng cho nghiên cứu ở tôm he đã được giới thiệu bởi Lightner (1996) đã được sử dụng trong nghiên cứu này [42].
a. Xử lý và đúc mẫu
Các mẫu tôm sau khi lấy ra khỏi dung dịch cố định, phần đầu ngực, cơ vân ở phần bụng, các chân bơi được cắt ra từ mẫu tôm và được làm mất nước bằng cách ngâm lần lượt vào các dung dịch cồn ethanol với nồng độ tăng dần (95% và 100%), mỗi thang cồn giữ khoảng 4 giờ. Sau đó mẫu được làm mềm bằng cách ngâm trong Methyl Salicylate nguyên chất với thời gian 12-24 giờ. Thấm mẫu trong parafin nóng chảy ở nhiệt độ 58-600C trong thời gian 6-8h. Cuối cùng đúc mẫu trong parafin, tạo thành khối hình hộp.
Mẫu tôm chân trắng không bộc lộ bệnh đỏ thân Kỹ thuật PCR để phân tích WSSV (kit Nam Khoa) Phân tích ký sinh trùng theo PP của Dogiel, 1929 Kỹ thuật RT-PCR để phân tích TSV (OIE, 2009) Mẫu tôm chân trắng bị
nhiễm hội chứng chết đỏ Phân lập vi khuẩn ở tôm bệnh (Whitman, K.A., 2004) Quan sát, mô tả, chụp hình, so sánh Phương pháp mô bệnh học (Lightner, 1996) Cảm nhiễm dịch lọc qua màng 0,2 µm (in vivo)
Xác định tác nhân gây ra hội chứng chết đỏ ở tôm chân trắng Chụp dưới
kính hiển vi điện tử (TEM)
Hình 2.2. Sơ đồ khối phương pháp nghiên cứu
b. Cắt, duỗi và sấy mẫu
Các lát cắt có độ dày 5-6 µm được cắt ra từ khối paraphin chứa mẫu bằng máy microtom, rồi được đặt lên bề mặt của nước ấm (450C) đã được bổ sung albumin từ lòng trắng trứng gà. Khi các lát cắt đã duỗi phẳng, dùng lam sạch để vớt các lát cắt và đặt chúng lên máy sấy lam ở nhiệt độ 45-600C trong 1-4h.
c. Nhuộm các tiêu bản mô bệnh học bằng Hematoxylin-Mayer và Eosin
Khi các lam mẫu đã khô sẽ được làm mất parafin bằng cách nhúng trong xylen 2 lần, mỗi lần 5 phút. Tiếp theo mẫu được làm no nước bằng cách nhúng trong cồn ethanol với các nồng độ giảm dần (100%, 90%, 70% và 50%), mỗi mức cồn giữ trong 2-3 phút. Sau đó, các lam mẫu được nhúng dưới nước vòi chảy nhẹ 3-6 lần, rồi nhuộm với Hematoxylin trong thời gian 4-6 phút, sau đó lấy mẫu ra rửa với nước vòi trong 4- 6 phút trước khi nhuộm lần 2 với Eosin trong 2 phút. Khi đã nhuộm xong, các lam mẫu này được làm mất nước bằng cách nhúng 10 lần trong mỗi dung dịch cồn 2 lần với nồng độ tăng dần (50%, 70%, 90%, 95% và 100%). Cuối cùng, các lam mẫu được làm trong bằng xylen 2 lần, 2-3 phút cho 1 lần, rồi để khô tự nhiên trong không khí, đậy bằng lamel với keo dán Bomcanada.
d. Đọc các tiêu bản mô bệnh học.
Các tiêu bản mô bệnh học được quan sát dưới kính hiển vi quang học ở các độ phóng đại khác nhau (100x, 200x và 400x) để xác định những biến đổi trong tổ chức mô và tế bào tôm bệnh dựa vào sự so sánh với mẫu làm từ tôm khỏe. Đọc kết quả mô bệnh học dựa vào các tài liệu của Lightner (1996), FAO, 402/2 (2001), Flegel (2006).
Hình 2.3. Các bước thực hiện của phương pháp mô bệnh học
Mẫu tôm bệnh và tôm khỏe được giải phẫu
Để khô tự nhiên và gắn tiêu bản bằng bomcanada Đọc tiêu bản dưới kính hiển vi quang học. So sánh sự biến đổi mô học của tôm bệnh và tôm khỏe
Cố định trong Davidson, rồi bảo quản
mẫu trong cồn 70% Xử lý mẫu và thấm parafin Đúc mẫu trong parafin Cắt mẫu bằng máy Microtom (5-6 µm) Nhuộm bằng Hematoxylin và Eosin
2.2.3.2. Phương pháp nghiên cứu vi khuẩn
Phương pháp phân lập vi khuẩn ở cá và giáp xác của Kimberley A. Whitman (2004) đã được sử dụng để phân lâp vi khuẩn từ các mẫu tôm bộc lộ dấu hiệu đỏ thân và từ những con tôm còn khỏe.
a. Phương pháp phân lập
Các bệnh phẩm lấy từ gan tụy và máu của tôm bệnh và tôm khỏe được cấy phân lập trên các loại môi trường: TSA (Tryptic Soy Agar), NA (Nutrient Agar), BA (Blood agar, 5% máu cừu), TCBS (Thiosulphate Citrate Bilesalt Sucrose), MSA (Manitol Salt agar, 7,5% NaCl), SSA (Streptococcus selective agar) có bổ sung thêm 2% NaCl. Các đĩa lồng sau khi cấy bệnh phẩm đã được ủ ở 28-30ºC trong 24-48h.
Các khuẩn lạc rời được tách riêng để tạo ra các chủng thuần. Các tiêu bản được nhuộm theo các phương pháp nhuộm: Gram (Hucker cải tiến, 1923), nội bào tử (Schaeffer-Fulton, 1933) và nhuộm màng tế bào (Anthony, 1931) nhằm quan sát hình thái, kích thước của các chủng vi khuẩn đã phân lập được. Các đặc điểm sinh hóa học được kiểm tra bằng kít API 20E kết hợp với thực hiện các phản ứng sinh hóa truyền
Hình 2.4. Các bước phân lập và định danh vi khuẩn
Mẫu mô gan tụy và máu
Phết lên lam sạch và để khô trong không khí Mẫu tôm chưa có dấu
hiệu bệnh (tôm khỏe)
Phân lập trên các môi trường chọn lọc và không
chọn lọc, (2% NaCl)
Nuôi cấy thuần chủng
Kít định danh API 20 Nhuộm Gram
Các phản ứng sinh hóa
Định danh VK (theo Bergey, 2001) Mẫu tôm có dấu hiệu bệnh
thống: O/F, KIA, Manitol di động, catalase, oxidase, khả năng chịu đựng muối, vibriostat 0/129 (10 µg và 150 µg) và khả năng thủy phân tinh bột của vi khuẩn.
Định danh các chủng vi khuẩn đã phân lập được dựa vào khóa phân loại của Bergey (2001).
b. Làm các tiêu bản mô phết từ gan tụy và máu của tôm bệnh
Các mẩu mô gan tụy được kẹp bằng panh đã tiệt trùng, phết một vùng mô mỏng trên các lam sạch (đã được ngâm trong dung dịch acid acetic từ 24- 48 h, rồi rửa sạch trong nước vòi và để khô). Máu tôm được rút ra từ gốc chân bò thứ 5 bằng một xilanh 1ml vô trùng rồi từng giọt máu được nhỏ trên các lam sạch, phết mỏng, để khô tự nhiên trong không khí hoặc cố định trên ngọn đèn cồn. Các tiêu bản phết đã khô được đưa vào nhuộm Gram theo phương pháp cải tiến của Hucker (1923).
2.2.3.3. Kiểm tra sự nhiễm virus của các mẫu tôm bệnh bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) và RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain (Polymerase Chain Reaction) và RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain
Reaction)
Các mẫu tôm có dấu hiệu chết đỏ được cố định trong cồn ethanol 95% dùng cho kỹ thuật PCR để xác định sự cảm nhiễm virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) và cho kỹ thuật RT-PCR để xác định virus gây bệnh Taura (TSV).
Hình 2.5. Các bước nhuộm gram (Hucker cải tiến, 1923)
Nhuộm Lugol, 1 phút Tiêu bản phết mô gan
tụy, máu đã khô
Tẩy sạch màu của vết bôi bằng cồn-aceton Fuchsin,
1-2 phút Đọc kết quả dưới
kính hiển vi
Nhuộm Crystal violet 30-60 giây
Hình 2.6. Các bước thực hiện của kỹ thuật PCR để kiểm tra tác nhân gây bệnh WSSV Mô mang và các phần phụ của tôm Phá mẫu bằng Digestion Solution Master Mix Tinh sạch DNA Tách chiết DNA bằng Wizard® SV Lysis Buffer Đọc kết quả dưới đèn UV
Nhân bản trong máy luân nhiệt (PCR)
Ủ mẫu qua đêm (16-18h),
Kỹ thuật PCR được thực hiện ở Viện Công nghệ sinh học & Môi trường- Trường Đại học Nha Trang. Bộ kit sử dụng cho kỹ thuật này được sản xuất bởi công ty CNSH Nam Khoa cho xác định WSSV. Tuy nhiên, do mẫu đưa vào xét nghiệm đã được cố định bằng cồn 95%, nên khâu tách chiết DNA được thay thế bằng quy trình tách chiết DNA theo bộ kit “Wizard® SV Genomic DNA Purification System” của công ty Promega (Mỹ) sản xuất.
Kỹ thuật RT-PCR được thực hiện tại Phòng Sinh học phân tử của Trung tâm Quan trắc Môi trường & cảnh báo Dịch bệnh, thuộc viện NCTS II, thành phố Hồ Chí Minh để phát hiện sự nhiễm virus gây hội chứng Taura (TSV). Mẫu tôm sau khi cố định trong cồn được phân tích bằng kỹ thuật RT-PCR theo phương pháp đã được hướng dẫn của tổ chức thế giới về sức khỏe động vật (OIE, 2009) [54].
2.2.3.4. Phương pháp kính hiển vi điện tử (Transmission electron microscopy-TEM)Tơ mang của tôm bệnh được cố định trong dung dịch Glutaraldehyde với tỷ lệ Tơ mang của tôm bệnh được cố định trong dung dịch Glutaraldehyde với tỷ lệ về thể tích mẫu với dung dịch là 1:10, được giữ ở 4-5ºC và được gửi phân tích ở Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, Hà Nội.
2.2.3.5. Thí nghiệm cảm nhiễm trong điều kiện in vivo để xác định tác nhân gây bệnh a . Sơ đồ khối thí nghiệm cảm nhiễm a . Sơ đồ khối thí nghiệm cảm nhiễm
Thí nghiệm cảm nhiễm in vivo để xác định tác nhân gây bệnh được tiến hành theo sơ đồ mô tả tại hình 2.7.
Tiêm dịch dưới lọc 0,2 µm
Cho ăn xác tôm bị bệnh
Tiêm vi khuẩn 103 cfu/mL; 0,02 mL/con
Tiêm kết hợp vi khuẩn (102 cfu/mL ) + dịch lọc 0,2 µm (Tỷ lệ phối trộn 1/1) NT 7 V.algi . + dịch lọc (0,02 mL/ con) NT 8 V.vulni + dịch lọc (0,02 mL/ con) NT 9 Staphy + dịch lọc (0,02 mL/ con)
- Mỗi nghiệm thức (NT) có 20 con tôm (khối lượng 6-8 g/con)/100 lít. Sục khí 24 h/ngày đêm. Xiphon đáy hàng ngày, thay nước 30 % khi nước bẩn.
- Tôm được cho ăn bằng thức ăn tổng hợp của công ty Grobest.
- Kiểm tra một số yếu tố môi trường: nhiệt độ, pH, độ mặn hàng ngày (2 lần/ngày).
- Theo dõi tình trạng của tôm: khả năng bắt mồi, hoạt động, màu sắc, tỷ lệ chết 3 lần/ngày.
- Các mẫu tôm hấp hối được cố định trong dung dịch Davidson cho kiểm tra mô bệnh học và trong cồn 95% cho PCR. - Thí nghiệm kết thúc sau 14 ngày và được lặp lại 2 lần.
Hình 2.7: Mô hình thí nghiệm trong điều kiện in vivo để tìm hiểu tác nhân gây bệnh XÁC ĐINH TÁC NHÂN GÂY RA HỘI
CHỨNG CHẾT ĐỎ Ở TÔM CHÂN TRẮNG NT 4 V.algino lyticus NT 5 V. vulnificus NT 6 Staphylo coccus sp1 NT 3 Cho ăn xác tôm trong 2 ngày ĐC 1 Tiêm 0,1 mL /con PBS NT 1 Tiêm 0,1 mL/con NT 2 Tiêm 0,02 ml/con ĐC 2 0,1 mL NaCl, 0,85%
b. Tạo ra dịch lọc (màng lọc 0,2 µm) từ tôm bệnh
Dịch lọc từ tôm bệnh trong dung dịch phosphate buffer saline (PBS) đã được thực hiện theo phương pháp của OIE (2009) [59] và Witteveldt (2004, 2006) [88, 89]. Dung dịch Phosphate Buffer Saline-PBS gốc (pH= 7,4) được pha chế từ: 14,2 g Na2PO4 + 2,02 g KH2PO4 + 2,14 g KCl + 87,7 g NaCl + 900 mL nước cất 2 lần (hấp tiệt trùng ở 121ºC) [6].
Dung dịch PBS pha loãng: lấy dung dịch PBS-gốc đem pha với nước cất 2 lần theo tỷ lệ 1:9 ta được dung dịch PBS pha loãng cần thiết. Cất giữ ở 4ºC.
Dung dịch PBS-virus gốc: Mẫu tôm bệnh được rã đông ở nhiệt độ phòng, sau đó phần đầu ngực và chân bơi được cắt ra và nghiền nát bằng máy nghiền đồng thể trong PBS-pha loãng theo tỷ lệ thể tích 1/10 (1 mẫu tôm/ 10 PBS pha loãng). Tiếp theo hỗn hợp này được ly tâm 2000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ 40C, sau đó phần dịch trong ở phía trên được lọc qua màng lọc 0,2 µm có sự hỗ trợ của máy hút chân không. Dịch lọc này được giữ ở 40C, không quá 24 h. Nếu muốn lưu giữ dịch lọc này lâu hơn 24 h cần bảo quản trong tủ đông sâu ở -80oC.
Dung dịch PBS-virus dùng cho thí nghiệm: đã được pha loãng từ PBS-virus gốc với PBS-pha loãng theo tỷ lệ 1:9.
c. Tuyển chọn tôm khỏe cho thí nghiệm
Tôm thí nghiệm đã được lựa chọn dựa vào các tiêu chí: tôm không có dấu hiệu bệnh, âm tính với WSSV bằng kỹ thuật PCR, âm tính với TSV bằng kỹ thuật RT-PCR. Tôm đưa vào thí nghiệm có khối lượng từ 6-8 g/con. Đã nuôi được 45 ngày trong ao lót bạt tại Bình Thuận, Ninh Thuận. Đàn tôm này được bơm ôxy vận chuyển kín về và được nuôi thuần dưỡng 3 ngày trước khi tiến hành thí nghiệm cảm nhiễm.
d. Tạo huyền dịch vi khuẩn và xác định định mật độ
Vi khuẩn đã được chọn để cảm nhiễm được nuôi cấy tăng sinh trên môi trường tổng hợp TSA (Tryptic Soy Agar, 2% NaCl), ở nhiệt độ 28-30ºC trong 24h. Huyền dịch của vi khuẩn được tạo ra bằng cách lấy các khuẩn lạc của vi khuẩn hòa tan trong nước muối sinh lý 0,85% vô trùng, vortex cho huyền dịch thuần nhất. Huyền dịch vi khuẩn được so màu theo thang độ đục Mc Farland làm chuẩn để có huyền dịch tương ứng với nồng độ vi khuẩn ở 102 cfu/mLvà 103 cfu/mL cho thí nghiệm. Tuy nhiên, huyền dịch này cũng được kiểm tra lại số lượng vi khuẩn bằng phương pháp cấy dàn
trải trên mặt thạch môi trường TSA và TCBS (cho vi khuẩn Vibrio). Số lượng vi khuẩn đã được xác định theo công thức:
e. Kiểm tra các chỉ số môi trường
Các thông số môi trường được kiểm tra 2 lần/ngày: 7 h và 14 h. Độ mặn (S‰): được đo bằng khúc xạ kế.
Nhiệt độ (tºC): được đo bằng nhiệt kế rượu thang 100º. pH: được xác định bằng test so màu của công ty CP.
2.3 Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu được xử lý bằng phần mềm MS-EXCEL.
K V
A
X
X: Là số lượng vi khuẩn/mL (cfu/ml)
A: Số khuẩn lạc trung bình đã tính được trong 1 độ pha loãng V: Thể tích nước đưa vào nuôi cấy
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Dấu hiệu chính của tôm chân trắng (L. vannamei) bị hội chứng chết đỏ
Từ 18 mẫu tôm bị hội chứng chết đỏ thu được từ các huyện Ninh hòa, Vạn Ninh và Cam Ranh, các dấu hiệu chính của bệnh đã được quan sát, chụp hình và mô tả. 100% (18/18) các mẫu này đều thể hiện dấu hiệu đầu tiên là cơ thể đều chuyển sang