Phương pháp phân lập vi khuẩn ở cá và giáp xác của Kimberley A. Whitman (2004) đã được sử dụng để phân lâp vi khuẩn từ các mẫu tôm bộc lộ dấu hiệu đỏ thân và từ những con tôm còn khỏe.
a. Phương pháp phân lập
Các bệnh phẩm lấy từ gan tụy và máu của tôm bệnh và tôm khỏe được cấy phân lập trên các loại môi trường: TSA (Tryptic Soy Agar), NA (Nutrient Agar), BA (Blood agar, 5% máu cừu), TCBS (Thiosulphate Citrate Bilesalt Sucrose), MSA (Manitol Salt agar, 7,5% NaCl), SSA (Streptococcus selective agar) có bổ sung thêm 2% NaCl. Các đĩa lồng sau khi cấy bệnh phẩm đã được ủ ở 28-30ºC trong 24-48h.
Các khuẩn lạc rời được tách riêng để tạo ra các chủng thuần. Các tiêu bản được nhuộm theo các phương pháp nhuộm: Gram (Hucker cải tiến, 1923), nội bào tử (Schaeffer-Fulton, 1933) và nhuộm màng tế bào (Anthony, 1931) nhằm quan sát hình thái, kích thước của các chủng vi khuẩn đã phân lập được. Các đặc điểm sinh hóa học được kiểm tra bằng kít API 20E kết hợp với thực hiện các phản ứng sinh hóa truyền
Hình 2.4. Các bước phân lập và định danh vi khuẩn
Mẫu mô gan tụy và máu
Phết lên lam sạch và để khô trong không khí Mẫu tôm chưa có dấu
hiệu bệnh (tôm khỏe)
Phân lập trên các môi trường chọn lọc và không
chọn lọc, (2% NaCl)
Nuôi cấy thuần chủng
Kít định danh API 20 Nhuộm Gram
Các phản ứng sinh hóa
Định danh VK (theo Bergey, 2001) Mẫu tôm có dấu hiệu bệnh
thống: O/F, KIA, Manitol di động, catalase, oxidase, khả năng chịu đựng muối, vibriostat 0/129 (10 µg và 150 µg) và khả năng thủy phân tinh bột của vi khuẩn.
Định danh các chủng vi khuẩn đã phân lập được dựa vào khóa phân loại của Bergey (2001).
b. Làm các tiêu bản mô phết từ gan tụy và máu của tôm bệnh
Các mẩu mô gan tụy được kẹp bằng panh đã tiệt trùng, phết một vùng mô mỏng trên các lam sạch (đã được ngâm trong dung dịch acid acetic từ 24- 48 h, rồi rửa sạch trong nước vòi và để khô). Máu tôm được rút ra từ gốc chân bò thứ 5 bằng một xilanh 1ml vô trùng rồi từng giọt máu được nhỏ trên các lam sạch, phết mỏng, để khô tự nhiên trong không khí hoặc cố định trên ngọn đèn cồn. Các tiêu bản phết đã khô được đưa vào nhuộm Gram theo phương pháp cải tiến của Hucker (1923).