Khi các loại virus khác nhau cảm nhiễm và gây bệnh ở các loài tôm biển như tôm chân trắng L. vannamei thường gây ra tác hại lớn, bởi hiện nay vẫn chưa có thuốc đặc trị và độc lực của tác nhân lại rất lớn. Do vậy, trong thời gian gần đây đã có nhiều công trình nghiên cứu phòng các bệnh virus cho tôm theo các hướng khác nhau như: bổ sung các chất có khả năng kích thích hệ thống miễn dịch ở tôm (immunostimulant) hay vaccine được tạo ra từ vỏ protein của WSSV (chủ yếu VP19 và VP28), hoặc lai tạo chọn giống để tạo ra các dòng tôm không mang các tác nhân gây bệnh nguy hiểm SPF (Specific Pathogen-Free) và dòng tôm kháng bệnh SPR (Specific Pathogen Resistance), hay một số nghiên cứu của các tác giả khác dùng các giải pháp môi trườngđể hạn chế tác hại của virus.
Zhao & ctv (2009), đã thử nghiệm dùng Lectin type C, được tách chiết từ tôm chân trắng (viết tắt Lv-CTL1) để kiểm tra khả năng chống lại WSSV của chất này trong điều kiện in vitro. Các tế bào máu của tôm chân trắng được nuôi, sau đó được thử thách với WSSV theo phương pháp của Jiang & ctv (2006) [36]. Kết quả thí nghiệm cho thấy chất Lv-CTL1 có khả năng bảo vệ các tế bào máu của tôm trước sự tấn công phá hủy của virus WSSV. Thêm vào đó kết quả thí nghiệm này đã cho thấy
tôm chân trắng khi bị cảm nhiễm hỗn hợp WSSV + Lv-CTL1 đã có khả năng giảm tỷ lệ chết của tôm xuống còn 47,8% so với 100% ở nghiệm thức đối chứng sau 9 ngày thí nghiệm. Kết quả nghiên cứu này đã chứng minh rằng loại Lv-CTL1 tách chiết từ tôm chân trắng có khả năng bảo vệ các tế bào máu và làm giảm có ý nghĩa tỷ lệ chết của loài tôm này khi bị nhiễm WSSV [95].
Nhóm tác giả Witteveldt & ctv (2004), đã thử nghiệm 2 loại vaccine có thành phần chính là các protein đặc biệt (VP19 và VP28) đã được tách chiết từ vỏ của WSSV tiêm vào cơ cho tôm sú P.monodon. Sau 25 ngày tiêm, đàn tôm này được thử thách với WSSV. Kết quả cho thấy tỷ lệ sống sót của tôm sú ở nghiệm thức có dùng VP28 cao hơn có ý nghĩa so với tôm ở nghiệm thức đối chứng không có bổ sung VP28. Nghiên cứu này đã mở ra một hướng mới cho chiến lược phòng chống WSSV bằng cách bổ sung vào tôm một số sản phẩm được sản xuất từ chính virus này, nhằm để thay thế cho sự thiếu hụt hệ thống miễn dịch đặc hiệu của tôm he [88].
Hai năm sau đó, Witteveldt & ctv (2006), đã tiếp tục hướng nghiên cứu sử dụng vaccine VP28 cho tôm, tuy nhiên đối tượng nghiên cứu trên loài tôm chân trắng (L. vannamei). Tôm chân trắng được cho ăn thức ăn đã được bao bởi VP28, sau 1 tuần tôm này được cảm nhiễm WSSV bằng phương pháp ngâm. Kết quả thí nghiệm đã cho thấy, tôm ở nghiệm thức cho ăn VP28 cũng xảy ra hiện tượng chết từ ngày thứ 2 sau cảm nhiễm, nhưng chỉ chết với tỷ lệ 50% rồi không xảy ra hiện tượng chết nữa, trong khi đó tôm ở nghiệm thức đối chứng dương đã bắt đầu chết từ ngày thứ 1 sau khi cảm nhiễm và chết 100% ở ngày thứ 3 sau cảm nhiễm [89].
Flegel (2008) đã cho biết, khi tôm sú (P. monodon) bị nhiễm WSSV, số lượng tế bào máu bị giảm thấp chỉ còn 20% so với tôm khỏe. Khi cho tôm sú ăn thức ăn được bao bằng protein vỏ VP28 của WSSV trong 7 ngày rồi sau đó cảm nhiễm WSSV, thì tôm được bổ sung VP28 qua thức ăn có tỷ lệ sống 80%, trong khi ở nghiệm thức đối chứng, tôm chết 100% sau 3 ngày cảm nhiễm [26].
Tại Việt Nam, Văn Thị Hạnh & ctv (2003), đã thông báo về kết quả thử nghiệm sản xuất chế phẩm globulin miễn dịch lòng đỏ trứng gà (AVS) bằng việc gây tạo miễn dịch cho gà mái với hỗn hợp virus WSSV và YHV. Chế phẩm ASV dùng cho tôm ăn đã có thể bảo vệ được 60-80% tôm khỏi sự thử thách với virus gây bệnh trong điều kiện thí nghiệm và sau 24 ngày tỷ lệ sống sót còn 70% và không thay đổi sau 50 ngày
tiếp theo, trong khi đó ở nghiệm thức đối chứng dương tôm chết 100% vào ngày thứ 18 sau khi gây nhiễm virus [5].
Nghiên cứu của Wongmaneeprateep & ctv (2010), về ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự đào thải WSSV của tôm chân trắng (L. vannamei). Kết quả của nghiên cứu này đã cho thấy, tôm chân trắng bị cảm nhiễm WSSV bằng cách tiêm hoặc cho ăn sẽ không bộc lộ dấu hiệu bệnh lý và không chết sau 14 ngày thí nghiệm nếu được nuôi ở nhiệt độ 32 ± 1ºC, trong khi tôm ở nghiệm thức đối chứng, sau khi bị cảm nhiễm WSSV được nuôi ở 28 ± 1ºC đã chết ngay ở ngày thứ 1-2 sau khi cảm nhiễm và chết 100% sau 5-7 ngày. Mẫu tôm từ nghiệm thức nuôi ở 32 ± 1ºC vẫn dương tính với WSSV khi kiểm tra bằng kỹ thuật PCR trong 6 ngày đầu, nhưng hoàn toàn âm tính từ ngày thứ 7 sau cảm nhiễm và không bộc lộ bệnh lý trong mô và tế bào khi kiểm tra bằng phương pháp mô bệnh học. Trong khi đó, các mẫu tôm thu từ nghiệm thức nuôi ở 28 ± 1ºC có kết quả dương tính 100% với WSSV bằng kỹ thuật PCR và mô bệnh học ở tất cả các ngày sau khi cảm nhiễm [90].
Một số nghiên cứu khác của Vidal & ctv (2001), Granja & ctv (2003, 2006), Rahman & ctv (2006), cũng đã khẳng định rằng, ở nhiệt độ cao (=32ºC) có thể ức chế được sự sao chép của WSSV cảm nhiễm trên tôm chân trắng [79, 30, 31, 64]. Tôm sau khi đã cảm nhiễm với WSSV, được thả nuôi ở nhiệt độ 32ºC, WSS đã không xảy ra trong suốt 40 ngày nuôi, tỷ lệ sống đạt từ 97-100%. Trong khi đó, tôm sau khi đã cảm nhiễm WSSV bằng cách tiêm vào cơ và nuôi ở nhiệt độ 26ºC, tôm bắt đầu chết ở ngày thứ 2 và chết 100% vào ngày thứ 8 sau cảm nhiễm. Nếu tôm được cảm nhiễm bằng cách cho ăn, bệnh đã xuất hiện ở ngày thứ 4 và chết 100% ở ngày thứ 15 [79]. Từ thí nghiệm cảm nhiễm in vivo đã cho thấy, ở nhiệt độ cao (32ºC) có thể ức chế hoạt động của protein vỏ VP28. Giả thuyết VP28 bị ức chế được đưa ra là do ảnh hưởng của nhiệt độ đã tác động đến các enzyme xúc tác cho quá trình sao chép từ đó đã ngăn cản sự sao chép của WSSV ở các giai đoạn sớm, tuy nhiên điều này vẫn chưa được chứng minh bằng các thử nghiệm sinh hóa học [64]. Các kết quả nghiên cứu trên đã đưa ra một số biện pháp có thểứng dụng để làm giảm tác hại của WSSV cho nghề nuôi tôm đó là: nâng nhiệt độ nước trong bể lên 32 ± 1ºC và duy trì ít nhất 7 ngày trước khi thả post larvae vào ao nuôi và chọn mùa vụ nuôi (nhiệt độ 32ºC) thích hợp với vật nuôi để khống chế các tác nhân gây bệnh [90, 31, 64].
Tại Brazil, tôm chân trắng đã từng bị thiệt hại lớn bởi 2 loại virus IHHNV và IMNV, do đó một chương trình phòng bệnh và chọn giống có sức đề kháng cao cho tôm chân trắng đã được thực hiện từ năm 2004. Gael & ctv (2009), đã thông báo một số kết quả nghiên cứu ban đầu của chương trình này. Các kỹ thuật PCR và LAMP (Loop-mediated Isothermal Amplification) đã được sử dụng để lựa chọn các con tôm mẹ hoàn toàn âm tính với các loại virus nguy hiểm và loại bỏ những cá thể (+) để phòng bệnh khi nuôi thương phẩm. Những con tôm bố mẹ không nhiễm tác nhân nguy hiểm và có sức khỏe tốt sẽ cho lai với nhau để tạo ra các thế hệ F1, F2, F3, F4 và F5. Khi cảm nhiễm IMNV vào tôm ở các thế hệ này ở độ mặn thấp đã cho tỷ lệ sống sót tăng dần qua các thế hệ, từ 3,2% đến 27,7%, trong khi đó tỷ lệ nhiễm các loại tác nhân ở các thế hệ lại giảm dần, từ 83,8% ở F1 xuống còn 17,7% ở F5 [28].
Ở Mỹ, đầu những năm 90 của thế kỷ trước cũng đã tiến hành một chương trình chọn giống và cải thiện chất lượng di truyền của chương trình nuôi tôm biển (US Marine Shrimp Farming Programe-USMSPF) và đến nay đã có những thành tựu nổi bật. Hiện nay, các nhà khoa học ở đây đã thành công trong việc tạo ra được dòng tôm chân trắng (L. vannamei) sạch bệnh (SPF) và đã cung cấp cho nhiều nơi trên thế giới. Thêm vào đó, năm 1998 các nhà khoa học đã bắt đầu nghiên cứu một hướng khác, đó là lai tạo ra dòng tôm kháng bệnh nguy hiểm (SPR) như TSV và bước đầu đã có một số thành công [49]. Khả năng đề kháng này đã được chứng minh khi dùng các chủng TSV để thử thách và kết quả cho thấy dòng tôm kháng TSV có tỷ lệ sống ngày càng cao hay nói cách khác khả năng kháng TSV của tôm chân trắng ngày càng được cải thiện. Argue & ctv (2002), đã nghiên cứu chọn giống nhưng cho kết quả đàn tôm sau khi thử thách TSV có tỷ lệ sống rất thấp 18,4% [14], tuy nhiên nghiên cứu của White & ctv (2002), đã cho tỷ lệ sống đã tăng lên 24-39% [86]. Các nghiên cứu tiếp theo của Wyban & ctv (2004), đã cho thấy tỷ lệ sống ngày càng được cải thiện, tỷ lệ sống khá cao từ 88-97%, trong khi dòng tôm mẫn cảm với TSV đã chỉ sống sót được từ 10-50% [92]. Đây là các công trình nghiên cứu công phu và đã mở ra một giải pháp có ý nghĩa thực tế cao trong việc quản lý bệnh ở tôm chân trắng nuôi thương phẩm.
CHƯƠNG 2
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ XỬ LÝ SỐ LIỆU 2.1. Đối tượng, thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu
Hội chứng chết đỏ ở tôm chân trắng (Litopenaeus vannamei Boon, 1931) nuôi thương phẩm tại Khánh Hòa.
Thời gian nghiên cứu
Từ tháng 15/5/2010 đến tháng 1/2011. Địa điểm nghiên cứu
- Mẫu tôm bệnh được thu từ các ao nuôi tôm chân trắng thương phẩm tại Khánh Hòa. - Phân tích mẫu đã được thực hiện tại:
+ Phân lập vi khuẩn và làm các tiêu bản mô bệnh học tại phòng thí nghiệm Bệnh học Thủy sản thuộc Bộ môn Bệnh học Thủy sản, khoa Nuôi trồng Thủy sản- Trường Đại học Nha Trang.
+ Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) đã được thực hiện tại Phòng công nghệ sinh học-Viện công nghệ Sinh học & Môi trường-Trường Đại học Nha Trang.
+ Phân tích RT-PCR (reverse transcription-PCR) tại Trung tâm Quan trắc Môi trường và cảnh báo Dịch bệnh-Viện Nghiên cứu NTTS II.
+ Virus gây bệnh chết đỏ được chụp dưới kính hiển vi điện tử (Transmission Electron Microscopy-TEM) tại Viện Vệ sinh Dịch tễ TW Hà Nội.
+ Thí nghiệm cảm nhiễm trong điều kiện in vivo được thực hiện tại trại tôm giống thuê tại phường Phước Hòa.
2.2. Phương pháp nghiên cứu đã sử dụng 2.2.1. Thu mẫu và cố định mẫu 2.2.1. Thu mẫu và cố định mẫu
Các mẫu tôm bệnh đã bộc lộ dấu hiệu đỏ thân được thu từ các ao đã có hiện tượng chết. Mỗi ao thu từ 25-30 con tôm bệnh có dấu hiệu đỏ thân nhưng còn sống. Do nhiều phương pháp phân tích đã được sử dụng, nên tôm bệnh thu từ ao được cố định và xử lý theo các cách khác nhau: 5 con tôm bệnh của mỗi ao được vận chuyển sống về đến Phòng thí nghiệm Bệnh học Thủy sản để phân lập vi khuẩn và kiểm tra ký sinh trùng, 10 con tôm bệnh được cố định vào 2 lọ đựng cồn ethanol 95% (5 con/lọ mẫu) dùng cho phân tích PCR và RT-PCR. Số tôm còn lại được tiêm dung dịch Davidson (cồn 95%: 330 ml, Formol 40%: 220 ml, acid Acetic: 115 ml và nước cất
335 ml) vào phần đầu ngực (2ml/con), sau đó cố định chúng trong chính dung dịch này với tỷ lệ về thể tích là 1/10, sau 36-48h các mẫu này được chuyển sang cồn ethanol 70% để bảo quản rồi dùng cho phân tích mô bệnh học. 10 con tôm chưa bộc lộ bệnh lý trong mỗi ao cũng đã được thu cho phân tích đối chứng so sánh. Tơ mang của tôm bệnh thu từ 3 ao bệnh được cố định trong dung dịch Glutaraldehyde với tỷ lệ về thể tích mẫu với dung dịch là 1:10, giữ mát trong đá khô để gửi đến phân tích tại phòng kính hiển vi điện tử.
Ngoài ra, tôm bệnh cũng được thu (1kg) và cấp đông ở nhiệt độ -200C trong 3 tuần dùng để làm vật liệu cho thí nghiệm trong điều kiện in vivo. Tôm khỏe dùng cho thí nghiệm cảm nhiễm được chuyển về trại bằng phương pháp vận chuyển kín, sau khi đã có kết quả âm tính với tác nhân gây bệnh bằng kỹ thuật PCR.
2.2.2. Sơ đồ khối các nội dung đã nghiên cứu của luận văn
2.2.3. Các phương pháp nghiên cứu chính đã sử dụng
Để thực hiện được các nội dung đã nêu ra trong hình 2.1, có nhiều phương pháp nghiên cứu bệnh ở động vật thủy sản đã được sử dụng để thực hiện trong luận văn này.
Cảm nhiễm trong điều kiện in vivo Các dấu hiệu chính của bệnh Vi khuẩn
Nghiên cứu tác nhân gây hội chứng chết đỏ trên tôm chân trắng
(Litopenaeus vannamei Boon, 1931) nuôi thương phẩm tại Khánh Hòa
Các dấu hiệu chính có ý nghĩa chẩn đoán
bệnh
Phát hiện các vi sinh vật cảm nhiễm trên các mẫu tôm bị
bệnh đỏ Thử nghiệm cảm nhiễm để tìm tác nhân gây bệnh Trạng thái hoạt động của tôm bệnh Kết luận và đề xuất ý kiến Virus Ký sinh trùng
2.2.3.1. Phương pháp mô bệnh học (Histopathology method)
Để nghiên cứu các biến đổi bệnh lý trong mô và tế bào của các tổ chức của tôm bệnh và góp phần xác định khả năng nhiễm các loại virus thường gặp ở tôm biển, phương pháp mô học ứng dụng cho nghiên cứu ở tôm he đã được giới thiệu bởi Lightner (1996) đã được sử dụng trong nghiên cứu này [42].
a. Xử lý và đúc mẫu
Các mẫu tôm sau khi lấy ra khỏi dung dịch cố định, phần đầu ngực, cơ vân ở phần bụng, các chân bơi được cắt ra từ mẫu tôm và được làm mất nước bằng cách ngâm lần lượt vào các dung dịch cồn ethanol với nồng độ tăng dần (95% và 100%), mỗi thang cồn giữ khoảng 4 giờ. Sau đó mẫu được làm mềm bằng cách ngâm trong Methyl Salicylate nguyên chất với thời gian 12-24 giờ. Thấm mẫu trong parafin nóng chảy ở nhiệt độ 58-600C trong thời gian 6-8h. Cuối cùng đúc mẫu trong parafin, tạo thành khối hình hộp.
Mẫu tôm chân trắng không bộc lộ bệnh đỏ thân Kỹ thuật PCR để phân tích WSSV (kit Nam Khoa) Phân tích ký sinh trùng theo PP của Dogiel, 1929 Kỹ thuật RT-PCR để phân tích TSV (OIE, 2009) Mẫu tôm chân trắng bị
nhiễm hội chứng chết đỏ Phân lập vi khuẩn ở tôm bệnh (Whitman, K.A., 2004) Quan sát, mô tả, chụp hình, so sánh Phương pháp mô bệnh học (Lightner, 1996) Cảm nhiễm dịch lọc qua màng 0,2 µm (in vivo)
Xác định tác nhân gây ra hội chứng chết đỏ ở tôm chân trắng Chụp dưới
kính hiển vi điện tử (TEM)
Hình 2.2. Sơ đồ khối phương pháp nghiên cứu
b. Cắt, duỗi và sấy mẫu
Các lát cắt có độ dày 5-6 µm được cắt ra từ khối paraphin chứa mẫu bằng máy microtom, rồi được đặt lên bề mặt của nước ấm (450C) đã được bổ sung albumin từ lòng trắng trứng gà. Khi các lát cắt đã duỗi phẳng, dùng lam sạch để vớt các lát cắt và đặt chúng lên máy sấy lam ở nhiệt độ 45-600C trong 1-4h.
c. Nhuộm các tiêu bản mô bệnh học bằng Hematoxylin-Mayer và Eosin
Khi các lam mẫu đã khô sẽ được làm mất parafin bằng cách nhúng trong xylen 2 lần, mỗi lần 5 phút. Tiếp theo mẫu được làm no nước bằng cách nhúng trong cồn ethanol với các nồng độ giảm dần (100%, 90%, 70% và 50%), mỗi mức cồn giữ trong 2-3 phút. Sau đó, các lam mẫu được nhúng dưới nước vòi chảy nhẹ 3-6 lần, rồi nhuộm với Hematoxylin trong thời gian 4-6 phút, sau đó lấy mẫu ra rửa với nước vòi trong 4- 6 phút trước khi nhuộm lần 2 với Eosin trong 2 phút. Khi đã nhuộm xong, các lam mẫu này được làm mất nước bằng cách nhúng 10 lần trong mỗi dung dịch cồn 2 lần với nồng độ tăng dần (50%, 70%, 90%, 95% và 100%). Cuối cùng, các lam mẫu được